RNA-Sequenzierungs-Analyse - Aufgaben

Author

Patrick Metzger - Institut für Medizinische Bioinformatik und Systemmedizin

1 Einführung

Wir bitten euch hier, die grundlegenden Schritte einer RNA-Sequenzierungs-Analyse durchzuführen. Wir stellen euch bereits die auf das menschliche Referenzgenom ausgerichteten Reads zur Verfügung, d.h. euer Ausgangspunkt sind die “Raw Counts” für alle Gene jeder Probe. Zusammen mit den Counts stellen wir euch die Annotationstabelle zur Verfügung, die die Proben-IDs mit den tatsächlichen biologischen Bedingungen verknüpft. Der Datensatz stammt aus einem wissenschaftlichen Projekt, an dem wir hier in Freiburg arbeiten. Der Datensatz enthält Expressionsdaten eines Rektumadenokarzinoms, welches Varianten in BRAFD594G, KRASG12A und TP53R175H trägt. Mit dem RNA-Seq-Experiment soll untersucht werden, welchen Einfluss die Medikamente Sorafenib und Trametinib auf das Expressionsmuster der Tumorzellen haben. Um die Vergleiche vornehme zu können wurde ebenfalls eine Kontrollprobe mit Dimethylsulfoxid (DMSO) generiert. DMSO wurde gewählt, da die Medikamente darin gelöst sind, um sie den Zellen zuverabreichen. Wir betrachten im folgenden also die biologischen Bedingungen DMSO, Sorafenib (Sora) und Trametinib (Tram). Für alle Bedingungen liegen zwei biologische Replikate vor.

Das Ziel dieser Aufgabe ist es die signifikant veränderten Gene zwischen der Kontrolle (DMSO) und den beiden Behandlungen (Sora und Tram) zu finden. Des weiteren interssiert uns auch, ob es Unterschiede zwischen den Behandlungen gibt. Dabei hilft uns in beiden Fällen die Analyse der differentiell exprimierten Gene (DEG).

Im folgenden beschreiben wir die Aufgaben und geben euch weitere Hinweise und Erklärungen.

Wir werden in den nächsten Wochen schrittweise folgende Punkte bearbeiten:

  1. Importieren der Count Daten und erstellen einer Count Matrix
  2. Verknüpfung der Daten zu tatsächlichen biologischen Bedingungen
  3. Erstellen einer Tabelle, die alle Gene und ihre zugehörigen Gen-Identifikatoren enthält.
  4. Berechnung einer Hauptkomponentenanalyse (PCA), um einen ersten Überblick über den Datensatz zu erhalten
  5. Die DEG-Analyse
  6. Vergleich zwischen den Medikamenten
  7. Gene-Set Enrichment Analyse (GSEA)
  8. Visualisieren und Exportieren der Ergebnisse

Daraus resultieren folgende Aufgaben/ Fragen für euch. Wir haben diese auf die drei verbleibenden Wochen aufgeteilt. Weitere Details findet ihr fortlaufend in diesem Dokument.

Aufgaben/ Fragen Woche 4

Vorbereitung:

  1. Importiert die Count-Daten und erstellt daraus eine Count-Matrix
  2. Erstellt eine Tabelle, die alle gemessenen Gene und all ihre verschiedenen IDs enthält.
  3. Ordnet den Proben ihre biologische Bedingung zu
  4. Erstellt das DESeq2 Objekt und normalisiert die Daten
  5. Erstellt zwei QC Abbildungen, einmal mit den Roh-Counts und einmal mit den normalisierten Count-Werten.

Aufgaben/ Fragen Woche 5

DEG-Analyse:

  1. Berechnet eine Principal Component Analysis (PCA) und stellt diese grafisch dar.
  2. Baut auf dem DESeq2 Objekt auf und führt die “Differentially Expressed Genes” (DEG) Analyse durch.
    1. Bestimmt die DEGs für die beiden Vergleiche Sorafenib vs DMSO und Trametinib vs DMSO
    2. Wie viele DEGs konntet ihr pro Vergleich identifizieren? (Cutoff padj < 0.05)
    3. Wie verteilen sich die Anzahl der DEGs auf hoch- bzw. runter-reguliert? (log2FoldChange > bzw. < 0)
    4. Stellt die Anzahlen grafisch z.B. als Barplot dar.
  3. Baut die signifikanten DEGs als Übersichtstabellen ins HTML ein.
  4. Stellt die Ergebnisse der DEG-Analyse mit Hilfe eines Volcano Plots dar.

Aufgabe/ Fragen Woche 6

Vergleich der beiden Medikamente:

  1. Findet Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen den beiden Medikamenten im Vergleich zu DMSO.
  2. Wendet einen Exakten Test nach Fischer an um aus den Genen veränderte Gensets/ Signalwege abzuleiten. Diese Art der Analyse nennt man funktionelle Analyse oder auch “Gene-Set Enrichment Analysis (GSEA)”.
  3. Stellt die Ergebnisse grafisch dar.

1.1 R Pakete

Verwendete R Paket:

Code
#if (!require("BiocManager", quietly = TRUE))
#    install.packages("BiocManager")
#BiocManager::install(version = "3.21")

library(DESeq2)
library(openxlsx)
library(pheatmap)
library(org.Hs.eg.db)
library(ggplot2)
library(FactoMineR)
library(ggrepel)
library(apeglm)
library(ggrepel)
library(viridis)
library(tidyverse)
library(kableExtra)
library(pheatmap)
library(genefilter)
library(EnhancedVolcano)
library(UpSetR)
library(msigdbr)
library(doMC) # falls es hiermit Probleme gibt könnt ihr das Paket auch weglassen
library(foreach) # falls es hiermit Probleme gibt könnt ihr das Paket auch weglassen
library(BiocParallel) # falls es hiermit Probleme gibt könnt ihr das Paket auch weglassen
# optional -> increase speed of analysis due to multicore processing
register(MulticoreParam(4)) # -> diese Zeile löschen, wenn es Probleme mit den Paketen doMC, foreach und/ oder BiocParallel gab

Hinweis: Falls diese nicht installiert sind, können sie mit dem Paketmanager von bioconductor BiocManager::install() oder install.packages() installiert werden.

Code
packages <- c(
  "doMC",
  "foreach",
  "BiocParallel",
  "UpSetR",
  "genefilter",
  "DESeq2",
  "openxlsx",
  "pheatmap",
  "org.Hs.eg.db",
  "ggplot2",
  "FactoMineR",
  "ggrepel",
  "apeglm",
  "viridis",
  "tidyverse",
  "kableExtra",
  "pheatmap",
  "EnhancedVolcano",
  "msigdbr"
)
BiocManager::install(packages)

1.2 Konfiguration

Code
## general config
mainDir <- "/Users/chris/Library/CloudStorage/GoogleDrive-christoph.kovacs@gmail.com/My Drive/BIDS Bioinformatik & Systembiologie 2025/KW4 Lernaufgabe/MIRACUM_BIDS_Bioinformatik_Systembiologie_RNA_Sequenzierung_Aufgabe"
analysisDir <- file.path(mainDir, "analysis")
degDIR <- file.path(analysisDir, "DEG")
gseaDIR <- file.path(analysisDir, "GSEA")
gageDIR <- file.path(analysisDir, "GSEA", "GAGE")
dir.create(degDIR, recursive = T)
dir.create(gageDIR, recursive = T)

Setzen des Arbeitsverzeichnisses: Die Funktion setwd() setz das Arbeitsverzeichnis und getwd() liest das aktuelle Arbeitsverzeichnis aus.

Code
setwd(mainDir)
getwd()
[1] "/Users/chris/Library/CloudStorage/GoogleDrive-christoph.kovacs@gmail.com/My Drive/BIDS Bioinformatik & Systembiologie 2025/KW4 Lernaufgabe/MIRACUM_BIDS_Bioinformatik_Systembiologie_RNA_Sequenzierung_Aufgabe"

Bei nicht UNIX basierten Betriebssystemen, z.B. Microsoft Windows, müsst ihr aufpassen, da dort der Backslash als Trenner verwendet wird. Ihr könnte aber, wenn ihr nicht sicher sein, auch die Funktion file.path(..., fsep = .Platform\$file.sep) vewenden, z.B.

Code
file.path(
  "~",
  "Documents",
  "Lehre",
  "BIDS",
  "Bioinformatik und Systembiologie",
  "2024",
  "BIDS_RNA_Seq_2024",
  "MIRACUM_BIDS_Bioinformatik_Systembiologie_RNA_Sequenzierung_Aufgabe_2024"
)

1.3 Funktionen

Wir stellen euch ein paar Funktionen zur Verfügung, die euch bei der Konvertierung der verschiedenen Gen-IDs unterstützen können. Alle Konvertierungen sind in der Hauptfunktion getGeneMat() zusammengefasst. Diese nimmt als Input die ENSEMBL Gen-IDs und konvertiert diese in die anderen und fasst alles zu einem “data.frame” zusammen.

Code
ensembl2entrez <- function(ensembl) {
  entrez <- mget(as.character(ensembl), org.Hs.egENSEMBL2EG, ifnotfound = NA)
  entrez <- lapply(entrez, function(i) return(i[1]))
  return(unlist(entrez))
}

entrez2ensembl <- function(entrez) {
  esbl <- mget(as.character(entrez), org.Hs.egENSEMBL, ifnotfound = NA)
  esbl <- lapply(esbl, function(i) return(i[1]))
  return(unlist(esbl))
}

entrez2symbol <- function(entrez) {
  symbol <- mget(as.character(entrez), org.Hs.egSYMBOL, ifnotfound = NA)
  symbol <- unlist(lapply(symbol, function(i) return(i[1])))
  return(symbol)
}

entrez2genename <- function(entrez) {
  symbol <- mget(as.character(entrez), org.Hs.egGENENAME, ifnotfound = NA)
  symbol <- unlist(lapply(symbol, function(i) return(i[1])))
  return(symbol)
}

getGeneMat <- function(ensIDs) {
  geneMat <- data.frame(ENSEMBL=ensIDs)
  geneMat$ENTREZ <- ensembl2entrez(geneMat$ENSEMBL)
  idxNA <- !is.na(geneMat$ENTREZ)
  sym <- entrez2symbol(na.omit(geneMat$ENTREZ))
  genename <- entrez2genename(na.omit(geneMat$ENTREZ))
  geneMat$Symbol <- NA
  geneMat$Symbol[idxNA] <- sym
  geneMat$Genename <- NA
  geneMat$Genename[idxNA] <- genename
  rownames(geneMat) <- geneMat$ENSEMBL
  return(geneMat)
}

2 Analyse

2.1 Vorbereitung

2.1.1 Importieren der Rohdaten aus dem Alignment und der Quantifizierung

Das ausrichten der Sequenzierungsschnipsel (Alignment der Reads) wurde mit dem Progamm STAR gemacht. STAR bietet außerdem die Möglichkeit auch gleich die Qunatifizierung der Expression vorzunemhen. Dabei wurde der Parameter --quantMode GeneCount verwendet. Hierzu wurde eine sogenannte GTF/ GFF Annotationsdatei benutzt, welche die Information beinhaltet, welches Gene zu welchen chromosomalen Koordinaten gehört. Wir betrachten hier ein un-stranded-RNA-Sequenzierungs Experiment.

Die einzelnen .tab Dateien beinhalten die Counts pro Gene. Dabei gibt die 1. Spalte den ENSEMBL Gen-Identifier an, z.B. ENSG00000223972 und die 2. Spalte die entsprechenden un-stranded RNA-Seq Counts. Diese beiden Spalten brauchen wir im Folgenden. Die ersten vier Reihen geben ein paar Zusammenfassungsstatistiken über die Count Datei und werden nicht benötigt.

Erstellt die Count Matrix und die Genreferenztabelle mit allen Genen und den zugehörigen IDs. Stellt die Count-Matrix, die betrachteten Gene und die Annotation der Proben zu den biologischen Bedingungen innerhalb des HTML Dokuments dar.

Code
library(readxl)

getwd()
[1] "/Users/chris/Library/CloudStorage/GoogleDrive-christoph.kovacs@gmail.com/My Drive/BIDS Bioinformatik & Systembiologie 2025/KW4 Lernaufgabe/MIRACUM_BIDS_Bioinformatik_Systembiologie_RNA_Sequenzierung_Aufgabe"
Code
# Annotation einlesen
annotation <- 
  read_excel("targets.xlsx") %>%
  mutate(group = as.factor(group)) %>%
  column_to_rownames("label") %>%
  mutate(label = rownames(.))
annotation
Code
read_counts <- function(file) {
  read_tsv(file, skip = 4, col_names = c("GeneID", "Count1", "Count2", "Count3"), show_col_types = FALSE) %>%
    select(GeneID, Count1)
}

# Eine Liste mit Count-Daten je Datei
count_list <- map(annotation$file, read_counts)

# Count-Matrix erstellen
count_matrix <- reduce(count_list, full_join, by = "GeneID") %>%
  setNames(c("GeneID", annotation$label)) %>%
  column_to_rownames("GeneID")
count_matrix
Code
# Matrix speichern
write.table(
  x = count_matrix,
  file = file.path(analysisDir, "counts.txt"),
  sep = "\t",
  quote = FALSE
)

# Gene (ENSEMBL-IDs) als Referenz extrahieren
gene_reference <- getGeneMat(rownames(count_matrix))
gene_reference

2.1.2 Vorbereiten des DESeq2 Objektes

Im nächsten Abschnitt wird das DESeq2-Modell erstellt. Damit wird die Grundlage für die spätere Analyse der differentiell exprimierten Gene (DEG) gelegt. Hierbei ist das Handbuch von DESeq2 sehr hilfreich. Wir importieren die Daten auf Grundlage der erstellten Count-Matrix, analog zu Count-Matrix-Import. Nach dem Import und dem Erstellen des DESeq2 Objektes müssen wir die Rohdaten einem Vorfilter Schritt unterziehen um sehr niedrige Counts zu entfernen. Hierbei is es hilfreich sich zu überlegen, wie viele biologische Replikate wir pro Bedingung haben. Idealerweise entfernt man alle Gene, die im vorliegenden Experiment in Summer über alle Bedingungen weniger als 5-10 Counts haben.

Wie viele Gene verlieren wir aufgrund von niedriger Expression?

Code
# Erstellen des DESeq2-Objekts
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(
  countData = count_matrix,
  colData   = annotation,
  design    = ~ group
)

# Setze untreated group
dds$group <- relevel(dds$group, ref = 'DMSO') 

# Vorfilter
keep <- rowSums(counts(dds) >= 5 ) >= 2
sum(keep) # keeping 18,198 records
[1] 18198
Code
sum(dim(count_matrix)[1]-sum(keep)) # discarding 39,575 records
[1] 39575
Code
dds <- dds[keep,] 

2.1.3 Normalisierung und Differentielle Expression

Nachdem wir die schwach exprimierten Gene entfernt haben können wir die Normalisierung der Daten vornehmen. Dazu müssen wir die “size factors” und die “Dispersion” bestimmen, damit wir den tatsächlichen Signifikanztest (wir wollen den Wald- Test verwenden) anwenden können. Außerdem müssen wir die normalisierten Expressionswerte extrahieren, damit wir damit z.B. eine PCA erstellen können. Dazu verwenden wir die regularized logarithm (rlog) Transformation. Die Werte können dann mit der Funktion assay() extrahiert werden.

Code
# Schätze size factors
dds <- estimateSizeFactors(dds)
sizeFactors(dds)
 1_DMSO_1  2_DMSO_2  3_Sora_1  4_Sora_2  5_Tram_1  6_Tram_2 
0.9552529 0.9770969 0.9240881 1.1048597 1.0997930 0.9844989 
Code
# Schätze Dispersion
dds <- estimateDispersions(dds)
plotDispEsts(dds)

Code
# Führe Wald Test durch
dds <- nbinomWaldTest(dds)
plotMA(dds)

Code
# rlog-Transformation, behalte Gruppeninformation
rld <- rlog(dds, blind = FALSE)
rlog_matrix <- assay(rld)
head(rlog_matrix)
                  1_DMSO_1   2_DMSO_2   3_Sora_1   4_Sora_2   5_Tram_1
ENSG00000227232  6.2826098  6.2283855  6.3679370  6.3316307  6.3757344
ENSG00000238009  0.3414577  0.3414201  0.3415136  0.3558799  0.3510621
ENSG00000233750  2.4318674  2.4257760  2.4163919  2.4074100  2.4074929
ENSG00000237683  7.0804001  6.8627312  6.9807804  6.9395316  7.0272746
ENSG00000268903 -0.3143222 -0.3198386 -0.3197793 -0.3150454 -0.3101142
ENSG00000239906  3.1359541  3.0614112  3.0570808  3.1020419  3.0734826
                  6_Tram_2
ENSG00000227232  6.3469033
ENSG00000238009  0.3574054
ENSG00000233750  2.4412742
ENSG00000237683  7.0166147
ENSG00000268903 -0.3144766
ENSG00000239906  3.1084416

2.1.4 QC Plot vor und nach der Normalisierung

Zur besseren Interpretation und dem Verständnis der Normalisierung bietet es sich an die Count-Werte der einzelnen Gene als kombinierten Boxplot für die jeweiligen Bedingungen darzustellen; jeweils vor und nach der Normalisierung. Die Konvertierung der Count-Werte in log2(count + 1) hat sich in dieser Hinsicht bewährt.

Erstellt bitte einen Boxplot mit den log-transformierten Counts vor und einen Boxplot nach der Normalisierung.

Hinweis: Normalisierte Counts erhaltet ihr nach anwenden der DESeq() Funktion und der Extraktion der Werte mit counts(ddsObject, normalized = TRUE). Generell empfielt sich ggplot2 zum Zeichnen zu verweden, da es vielfälltige Möglichkeiten bietet und dadurch sehr ansehnliche Abbildungen erstellen kann. Um ein für ggplot2 passendes data.frame zu erstellen, können Pakete wie z.B. reshape2, dplyr, etc. hilfreich sein.

Code
## Roh-Counts extrahieren
raw_counts <- counts(dds)

# Log2 transformieren
log_raw <- log2(raw_counts + 1)

# Daten für ggplot umformen
df_raw <- as.data.frame(log_raw) %>%
  rownames_to_column("gene") %>%
  pivot_longer(-gene, names_to = "sample", values_to = "log2count") %>%
left_join(as.data.frame(colData(dds)) %>%
rownames_to_column("sample"), by = "sample")

# Boxplot erstellen
df_raw %>%
  ggplot(aes(x = sample, y = log2count, fill = group)) +   # why not group?
  geom_boxplot(outlier.size = 0.3) +
  theme_bw() +
  labs(title = "Counts (trans) pro Bedingung",
       x = "Bedingung", y = "Counts (trans)") +
  theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1))

Code
## Normalisierte Counts extrahieren
norm_counts <- counts(dds, normalized = TRUE)

# Log2 transformieren
log_norm <- log2(norm_counts + 1)

# Daten für ggplot umformen
df_norm <- as.data.frame(log_norm) %>%
  rownames_to_column("gene") %>%
  pivot_longer(-gene, names_to = "sample", values_to = "log2normCount") %>%
left_join(as.data.frame(colData(dds)) %>%
rownames_to_column("sample"), by = "sample")

# Boxplot erstellen
df_norm %>% 
  ggplot(aes(x = sample, y = log2normCount, fill = group)) +
  geom_boxplot(outlier.size = 0.3) +
  theme_bw() +
  labs(title = "Counts (norm, trans) pro Bedingung",
       x = "Bedingung", y = "Counts (norm, trans)") +
  theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1))

2.2 PCA - Principal Component Analysis

Bevor wir mit der tatsächlichen DEG-Analyse fortfahren berechnen wir eine PCA um einen ersten Eindruck von unseren Daten zu bekommen. Dazu verwenden wir die eben erstellten, normalisierten Expressionswerte (rlog-Werte). In der PCA sollen die Bedingungen als “individuals” betrachtet und die Gene als “variables”. Im Resultat soll jede Probe dargestellt und in seine Haupkomponenten zerlegt werden. Hierzu könnt ihr z.B. das Paket FactoMineR verwenden. Bitte erstellt einen sog. “Individuals Graph” mit den Proben und den ersten beiden Hauptkomponenten als Achsen. Wenn ihr das FactoMineR Paket verwendet findet ihr diese Infos unter pca$ind$coord. Um einen visuell ansprechenderen Abbildung zu erhalten würde ich empfehlen die Abbildung wieder mit dem Paket ggplot2 zu erstellen. Mit der Funktion ggsave() könnte ihr die mit ggplot2 erstellte Abbildung sehr einfach in ein geeignetes Format, z.B. PDF, png, etc. exportieren.

Erstellt eine PCA und stellt diese als Abbildung im HTML Dokument dar.

Code
### PCA: Principal Component Analysis (linear relationship analysis)
pca <- plotPCA(rld, intgroup = "group", returnData = TRUE)
# Variance explained
percentVar <- round(100 * attr(pca, "percentVar"))

# Plot
ggplot(pca, aes(PC1, PC2, color = group, label = name)) +
  geom_point(size = 3) +
  geom_text(vjust = -1.2, size = 3) +
  xlab(paste0("PC1: ", percentVar[1], "% variance")) +
  ylab(paste0("PC2: ", percentVar[2], "% variance")) +
  coord_fixed() +
  theme_minimal()

Code
# Interpretation
# ==============
# PCA erklärt 87% der Gesamtvarianz in 2 Dimensionen
# DMSO bildet einen Cluster, die Samples kann als (linear) homogen angenommen werden
# Sorafenib bildet einen Cluster, die Samples können daher als (linear) homogen angenommen werden
# Trametinib bildet zwei Cluster, die Samples sind daher nicht (linear) homogen


### MDS: Multi-dimensional Scaling (linear relationship analysis)
# Compute distance matrix from rlog-transformed data
d <- dist(t(assay(rld)))  # transpose because samples are columns
# Perform classical MDS (multi-dimensional scaling)
mds <- cmdscale(d, k = 2)  # k = number of dimensions (2D)
# Create a data frame with sample information
mds_df <- as.data.frame(mds)
mds_df$group <- colData(rld)$group  # adjust 'group' to your grouping column
# Plot with ggplot2
ggplot(mds_df, aes(x = V1, y = V2, color = group)) +
  geom_point(size = 3) +
  labs(x = "MDS1", y = "MDS2") +
  theme_minimal()

Code
# Interpretation
# ==============
# MDS zeigt ähnliches Bild wie PCA
# Sorafenib bildet einen Cluster, die Samples können daher als (linear) homogen angenommen werden
# DMSO und Trametinib bilden jeweils zwei Cluster, die Samples scheinen daher nicht-lineare Beziehungen zu haben, die von der MDS nicht erfasst werden

### t-SNA: t-distributed stochastic neighbor embedding for non-linear relationship analysis
library(Rtsne)
# Extract assay data (genes x samples) and transpose to samples x genes
mat <- t(assay(rld))

# Optionally: reduce to top variable genes to speed up and denoise
top_var_genes <- head(order(apply(mat, 2, var), decreasing = TRUE), 500)
mat_top <- mat[, top_var_genes]

# Run t-SNE (you can adjust perplexity; try 5–30 depending on sample size)
set.seed(42)  # for reproducibility
tsne_out <- Rtsne(mat_top, dims = 2, perplexity = 1, verbose = TRUE)
Performing PCA
Read the 6 x 6 data matrix successfully!
Using no_dims = 2, perplexity = 1.000000, and theta = 0.500000
Computing input similarities...
Building tree...
Done in 0.00 seconds (sparsity = 0.611111)!
Learning embedding...
Iteration 50: error is 65.453220 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 100: error is 103.638598 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 150: error is 52.926096 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 200: error is 57.076918 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 250: error is 54.445751 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 300: error is 0.322697 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 350: error is 0.138587 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 400: error is 0.109798 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 450: error is 0.109646 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 500: error is 0.096316 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 550: error is 0.108245 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 600: error is 0.088462 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 650: error is 0.108734 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 700: error is 0.105920 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 750: error is 0.109760 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 800: error is 0.108264 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 850: error is 0.109467 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 900: error is 0.109448 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 950: error is 0.109438 (50 iterations in 0.00 seconds)
Iteration 1000: error is 0.109435 (50 iterations in 0.00 seconds)
Fitting performed in 0.00 seconds.
Code
# Combine with metadata
tsne_df <- data.frame(
  TSNE1 = tsne_out$Y[,1],
  TSNE2 = tsne_out$Y[,2],
  group = colData(rld)$group  # adjust if your metadata column is named differently
)

# Plot with ggplot2
ggplot(tsne_df, aes(x = TSNE1, y = TSNE2, color = group)) +
  geom_point(size = 3) +
  labs(title = "t-SNE of RNA-seq samples", x = "t-SNE 1", y = "t-SNE 2") +
  theme_minimal()

Code
# Interpretation
# ==============
# Ganz deutliche Cluster zu erkennen; DMSO und Tramatinib bilden jeweils einen Cluster, zusammen einen größeren. Daher kann davon ausgegangen, dass Trametinib keine über die Baseline hinausgehende nicht-lineare Beziehung aufweisen.
# Sorafenib bildet einen Cluster deutlich abseits der Kontrollgruppe und von Trametinib, das kann als Indikator für einen tatsächlichen Unterschied gewertet werden

2.3 Differentielle Expressions Analyse

Um die DEG-Analyse durchzuführen müssen wir noch definieren an welchen tatsächlichen Vergleichen wir interessiert sind. Dazu können wir uns eine sog. Kontrast-Matrix erstellen. Folgende Vergleiche sind für uns interessant:

  • Sorafenib vs DMSO und
  • Trametinib vs DMSO,

da wir verstehen wollen, welchen Einfluss die beiden Inhibitoren auf unsere Zellen haben. Für beide Vergleiche bestimmen wir die DEGs und exportieren diese bis zu einem korrigierten (FDR) p-Wert < 0.05 in eine Tabelle. Hierzu verwenden wir die Funktion lfcShrink(). Damit die Tabellen für unsere Kollaborationspartner besser verständlich werden ist es essentiell, dass die Gene mit allen IDs, hautpsächlich aber dem Symbol, in den Ergebnissen enthalten sind.

Berechnet die DEGs für die beiden Vergleiche Sorafenib vs DMSO und Trametinib vs DMSO. Erstellt Tabellen, die die signifikanten Gene bis zu einem FDR-korrigierten p-Wert < 0.05 beinhalten. Achtet hier darauf auch das Symbol in der Ergebnistabelle zu haben. Ansonsten fällt die Zuordnung der Gene schwer. Zeigt diese im HTML Dokument. Exportiert die Ergebnisse der DEG-Analyse zusätzlich als Excel-Tabellen.

Bei der Darstellung der DEG-Ergebnisse innerhalb des HTML Dokuments müsst ihr nicht alle Spalten darstellen. Dies wird schnell sehr unübersichtlich. Ich würde sagen, dass ihr maximal drei Angaben braucht: Symbol, log2FoldChange und den korrigierten p-Wert. Bei der Darstellung innerhalb des HTMLs kann die Funktion kable() hilfreich sein.

Wie viele Gene sind pro Vergleich signifikant reguliert? Wie verteilt sich die Anzahl auf hoch- bzw. runter-regulierte Gene? Stellt diese Ergebnisse anschaulich dar.

Hinweis: Hierzu könnt ihr den log2FoldChange aus der DEG-Analyse verwenden.

Code
## ref:
## https://www.youtube.com/watch?v=0b24mpzM_5M (theory)
## https://www.youtube.com/watch?v=OzNzO8qwwp0 (R)

if (!require("ashr", quietly = TRUE))
    install.packages("ashr")

library(ashr)

dds <- DESeq(dds)

# Sorafenib vs DMSO
res_sora <- lfcShrink(dds, contrast = c("group", "Sorafenib", "DMSO"), type = "ashr")

# Trametinib vs DMSO
res_tram <- lfcShrink(dds, contrast = c("group", "Trametinib", "DMSO"), type = "ashr")

# Hilfsfunktion für Filter & Format
filter_deg <- function(res) {
  as.data.frame(res) |>
    rownames_to_column("ENSEMBL") |>
    left_join(gene_reference[, c("ENSEMBL", "Symbol")], by = "ENSEMBL") |>
    filter(padj < 0.05 & !is.na(Symbol)) |>
    select(Symbol, log2FoldChange, padj) |>
    arrange(desc(abs(log2FoldChange)))  # nach Effektgröße sortieren
}

deg_sora <- filter_deg(res_sora)
deg_tram <- filter_deg(res_tram)

## compare up and down-regulated genes
count_regulation <- function(df) {
  df |> 
    mutate(Regulation = case_when(
      log2FoldChange > 0 ~ "Upregulated",
      log2FoldChange < 0 ~ "Downregulated"
    )) |> 
    count(Regulation)
}

sora_counts <- count_regulation(deg_sora)
tram_counts <- count_regulation(deg_tram)
 
# Visualize
sora_counts$Comparison <- "Sorafenib vs DMSO"
tram_counts$Comparison <- "Trametinib vs DMSO"
all_counts <- bind_rows(sora_counts, tram_counts)

ggplot(all_counts, aes(x = Comparison, y = n, fill = Regulation)) +
  geom_bar(stat = "identity", position = "dodge") +
  labs(title = "Differenziell regulierte Gene", y = "Anzahl Gene") +
  theme_minimal()

2.3.1 Identifizierte DEGs als Tabellen

Code
kable(head(deg_sora, 10), caption = "Top DEGs: Sorafenib vs DMSO")
Top DEGs: Sorafenib vs DMSO
Symbol log2FoldChange padj
TNS4 -4.276618 0e+00
FGF19 -3.548554 6e-07
SPRY4 -3.523185 0e+00
DUSP6 -3.409679 0e+00
PCK1 2.741600 0e+00
FOSL1 -2.659953 0e+00
PPP2R2C -2.606917 0e+00
BNIP5 2.260004 0e+00
DUSP2 -2.197986 0e+00
KIAA0040 -2.185101 0e+00
Code
kable(head(deg_tram, 10), caption = "Top DEGs: Trametinib vs DMSO")
Top DEGs: Trametinib vs DMSO
Symbol log2FoldChange padj
TNS4 -2.510089 0
RBBP8NL 1.500431 0
EGR1 -1.434658 0
ASCL2 1.407300 0
FOSL1 -1.344055 0
BMF 1.338612 0
CYP1A1 1.332714 0
IER3 -1.230418 0
KIAA0040 -1.157227 0
MAB21L4 1.117756 0

2.3.1.1 Sorafenib vs. DMSO

Code
kable(df[, c("Symbol", "log2FoldChange", "padj")], row.names = FALSE, "html", col.names = c("Symbol", "log2FC", "adj. p-value"))  %>%
  kable_styling() %>%
  scroll_box(width = "100%", height = "800px")

2.3.1.2 Trametinib vs. DMSO

2.3.2 Visuelle Darstellung: Volcano Plot

Zusätzlich zur tabellarischen Darstellung der DEG-Ergebnisse kann man diese auch als sog. “Volcano Plots” darstellen. Dabei werden alle Gene als Punkte mit ihrem Signifikanzwert (y-Achse) und dem log2FoldChange (x-Achse) dargestellt. Die signifikanten Gene werden dabei farblich hervorgehoben. Mit dem R Paket EnhancedVolcano haben wir gute Erfahrungen gemacht.

Erstellt jeweils einen Volcano Plot für die beiden Vergleiche.

Code
if (!requireNamespace("EnhancedVolcano", quietly = TRUE)) {
  BiocManager::install("EnhancedVolcano")
}
library(EnhancedVolcano)

2.3.2.1 Volcano Plot: Sorafenib vs. DMSO

Code
EnhancedVolcano(res_sora,
    lab = gene_reference$Symbol[match(rownames(res_sora), gene_reference$ENSEMBL)],
    x = 'log2FoldChange',
    y = 'padj',
    pCutoff = 0.05,
    FCcutoff = 1,
    pointSize = 2.0,
    labSize = 3.0,
    title = 'Sorafenib vs DMSO',
    subtitle = 'Differentiell exprimierte Gene',
    caption = 'log2FC > 1, FDR < 0.05',
    legendLabels = c('NS', 'Log2FC', 'FDR', 'FDR & Log2FC'),
    legendPosition = 'right')

2.3.2.2 Volcano Plot: Trametinib vs DMSO

Code
EnhancedVolcano(res_tram,
    lab = gene_reference$Symbol[match(rownames(res_tram), gene_reference$ENSEMBL)],
    x = 'log2FoldChange',
    y = 'padj',
    pCutoff = 0.05,
    FCcutoff = 1,
    pointSize = 2.0,
    labSize = 3.0,
    title = 'Trametinib vs DMSO',
    subtitle = 'Differentiell exprimierte Gene',
    caption = 'log2FC > 1, FDR < 0.05',
    legendLabels = c('NS', 'Log2FC', 'FDR', 'FDR & Log2FC'),
    legendPosition = 'right')

2.4 Vergleich der beiden Medikamente

Um die Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den beiden Medikamenten bzw. deren jeweiligen Vergleiche zu DMSO zu finden, können wir das R Paket UpSetR verwenden. Da wir beide Medikament zu DMSO verglichen haben, ist das Vorgehen sinnvoll und wir können direkt Unterschiede und Gemeinsamkeiten identifizieren. Wir nehmen den Vergleich auf Ebene der signifikant regulierten Gene, getrennt nach hoch- bzw. runter-Regulation, vor. Dazu legen wir uns zwei Listen an, analog zu Basic Usage. Eine für die hoch-regulierten und eine für die runter-regulierten Gene. Danach kann der Befehl upset(fromList(list)) verwendet werden. Um an die einzelnen Gene in den verschiedenen “Sets” zu kommen, stellen wir euch eine Funktion upSetSets(list) zur Verfügung. Als Input Parameter übergebt ihr dieser Funktion die Liste, die auch für upset() verwendet wird.

Führt den Vergleich der beiden Medikamente durch.

Code
if (!requireNamespace("UpSetR", quietly = TRUE)) {
  install.packages("UpSetR")
}
library(UpSetR)

# function to obtain genes per set
upSetSets <- function(sets){
  list_names <- names(sets)
  attach(sets,warn.conflicts = F)
  res <- lapply(1:length(list_names),function(y){
    combinations <- combn(list_names,y)
    res<-as.list(apply(combinations,2,function(x){
      if(length(x)==1){
        p <- setdiff(get(x),unlist(sapply(setdiff(list_names,x),get)))
      }

      else if(length(x) < length(list_names)){
        p <- setdiff(Reduce(intersect,lapply(x,get)),
        Reduce(union,sapply(setdiff(list_names,x),get)))
      }

      else p <- Reduce(intersect,lapply(x,get))

      if(!identical(p,character(0))) p
      else NA
    }))

    if(y==length(list_names)) {
      res[[1]] <- unlist(res);
      res<-res[1]
    }
    names(res) <- apply(combinations,2,paste,collapse="-")
    res
  })
  result <- lapply(res, function(x) x[!is.na(x)])
  result <- unlist(result, recursive = F)
  result <- lapply(result,function(x) data.frame(ID=x))
  return(result)
  detach(sets)
}

2.4.1 Gemeinsamkeiten

2.4.1.1 Durch beide Medikamente hoch-regulierte Gene

Code
up_sora <- deg_sora |> filter(log2FoldChange > 0) |> pull(Symbol)
up_tram <- deg_tram |> filter(log2FoldChange > 0) |> pull(Symbol)

up_list <- list(
  Sorafenib = up_sora,
  Trametinib = up_tram
)

2.4.1.2 Durch beide Medikamente runter-regulierte Gene

Code
down_sora <- deg_sora |> filter(log2FoldChange < 0) |> pull(Symbol)
down_tram <- deg_tram |> filter(log2FoldChange < 0) |> pull(Symbol)

down_list <- list(
  Sorafenib = down_sora,
  Trametinib = down_tram
)
Code
## Plots
# Hochregulierte Gene
upset(fromList(up_list), 
      order.by = "freq",
      mainbar.y.label = "Gemeinsame hochregulierte Gene",
      sets.x.label = "Gene pro Medikament")

Code
# Runterregulierte Gene
upset(fromList(down_list), 
      order.by = "freq",
      mainbar.y.label = "Gemeinsame runterregulierte Gene",
      sets.x.label = "Gene pro Medikament")

Code
head(upSetSets(up_list))  # für hochregulierte Gene
$Sorafenib
              ID
1           PCK1
2          DUSP8
3           NEU4
4         MOGAT2
5        TM4SF20
6           USP2
7         B3GNT8
8           AMOT
9           PDK4
10     LINC01637
11         PLPP1
12       CYP27A1
13        TMEM37
14           SHD
15       FAM161B
16        LRRC31
17        VPS37D
18          PSCA
19          ANK3
20        NEURL3
21          DLL4
22          PMM1
23        SEMA6A
24        PIWIL2
25         CLDN9
26       CNTNAP1
27         AQP11
28         STBD1
29      TMEM238L
30          BTG2
31     LINC01558
32        TRANK1
33       MKRN2OS
34         SMPD3
35          RHOU
36       OLFML2A
37        SECTM1
38          FN3K
39           MAF
40          BCL6
41         HOXB3
42         FGFR2
43         TREX1
44        RNF186
45        GPR161
46          FMO5
47          PROC
48         DMBX1
49          IRF8
50       GADD45A
51         SPON2
52       ALDH3B1
53       GAL3ST4
54         CLIP2
55           JUN
56       PLEKHH3
57         TRPS1
58         TNNC1
59          GBP2
60        KBTBD3
61          DGKQ
62       SLC6A12
63       SLCO2B1
64          ALPG
65       STARD13
66         USP30
67        CARD14
68         ABCG1
69         OTUD1
70         PDE5A
71       CBFA2T2
72       HSD11B2
73          RHOV
74            MB
75     RAB11FIP4
76         BOLA1
77          BMP2
78         TRIM6
79        ZNF618
80        ENTPD8
81          ACP3
82      TMEM150B
83           CKB
84        PHLDA3
85          IQUB
86        SOWAHD
87        SLC51A
88          ESPN
89          TLX1
90          AJM1
91          RARB
92        SEMA3F
93        KCNMB4
94        NHERF4
95        ZNF219
96         HOXB8
97         ABHD4
98         KMT5C
99       ALDH6A1
100    RAB11FIP3
101         VASN
102       SOWAHA
103         AQP7
104       BTN2A2
105        MKNK2
106        WNT11
107        ANXA9
108         LCA5
109       CHST12
110      DENND4C
111         CBX4
112        HLA-H
113         AQP1
114         ECH1
115       PRKAB2
116         IRF1
117       ZNF608
118         PDK2
119        HHLA2
120     ARHGEF28
121       PGCKA1
122        HDHD3
123        CLIC3
124      SLC38A4
125        OCEL1
126          BAD
127        ABCC6
128        AVPI1
129        CXXC4
130       DUSP16
131       EHHADH
132       CASP10
133       PGM2L1
134        MIEF2
135        UNC5A
136        PLIN4
137       METRNL
138         SIK1
139       ANKRD9
140       RNF208
141       KBTBD7
142      ALDH1A1
143        HOXB6
144       COL4A2
145      PLEKHG6
146       PWWP2B
147        KCNS3
148        SYNPO
149        CLDN3
150          GPT
151        RAB30
152       PYCARD
153         FDXR
154     PPP1R16A
155       ZNF425
156         BBC3
157       GPRC5C
158         RFX1
159     SLC25A42
160      GRAMD1C
161      BCL2L15
162       CDKN1C
163        PTGES
164      SLC11A2
165       TMEM79
166    RNA5-8SP2
167          LTB
168       SOWAHB
169       ZNF552
170     TMEM229B
171         LRP1
172         MNX1
173       ANTKMT
174       VPS33B
175          SP6
176        GLIS3
177         PER1
178       SMIM14
179        NINJ1
180       ANKS4B
181         NME3
182        BATF2
183        HOXB5
184      PPP1R1B
185         GJB1
186      TSPAN33
187        BICRA
188        AKAP7
189          PML
190        THAP8
191        APOL1
192      B3GALT4
193      CCDC106
194      ZFTRAF1
195        CREG2
196         BBLN
197        ICAM1
198      ZKSCAN3
199        MZT2B
200       SLC1A4
201       SCAND1
202         DAB2
203       ZNF500
204         SCIN
205       MAMSTR
206     C12orf76
207        DECR2
208         TAP1
209       UNC119
210     C15orf48
211     TP53INP1
212        TMEM9
213         KSR1
214        PRSS8
215        HDAC5
216       ALKBH7
217        DEPP1
218      BCL2L11
219       PSAPL1
220       NICOL1
221       ZNF563
222       ENTPD5
223        H1-10
224      MARCHF2
225       PBXIP1
226        ACACB
227       MAP3K8
228      TSC22D4
229        NR2F6
230         ELF5
231        TTBK1
232       SEPHS2
233        CAPN5
234       ZNF213
235       ZNF436
236       PHF21A
237        SIDT2
238    LINC00847
239       ZYG11B
240        CIDEC
241     TRAF3IP2
242       MGAT4A
243        MANBA
244         ARNT
245        ZFP14
246        LPIN2
247        METRN
248        DGCR6
249       FAM53B
250       ZNF211
251        PLPP3
252       SLC2A8
253       ZNF415
254       SLC9A1
255       SPATA7
256     ARHGEF37
257      PIK3IP1
258        PUS10
259       PCYOX1
260         GLCE
261       ZNF688
262       NYNRIN
263     ARHGAP33
264        H2BC5
265        PTPN6
266       KLHDC2
267        HELZ2
268         TP73
269         CTSD
270        PTGR1
271         WHRN
272         JDP2
273      TP53I11
274        STK11
275        VPS11
276      ATP5F1D
277       RIMBP2
278        PRKCD
279       SPAG16
280       TRIM68
281           TH
282        MYRFL
283        P2RX4
284        CEBPD
285         JAG2
286         SUFU
287          AMN
288      RPL13P5
289       PLXNB2
290      PPP1R37
291      TMEM143
292        SNAI3
293    GATA6-AS1
294       RWDD2A
295       DNAJB4
296       MRPL34
297         CRAT
298       ATF7IP
299        SPHK2
300         SYT8
301        RIPK4
302        AP5Z1
303        CDHR5
304        MATN2
305        AP3S2
306        ARMC2
307          REL
308    POLR1HASP
309       OSBPL7
310         PECR
311     C1orf198
312        TRPM4
313        BCAS1
314       CYP4F3
315        PTPRR
316        ESPL1
317       MFSD4A
318         LMF2
319       ZNF768
320        CASZ1
321       CERCAM
322        MGAT3
323  PRKAR2A-AS1
324     CEP192P1
325       EPS8L2
326       PPFIA3
327       FBXO34
328        MIGA2
329       CORO1B
330        PDZK1
331      STARD10
332         OTX1
333         AOC1
334         MPND
335         UCP2
336         ANO8
337        SESN2
338       RAB11B
339         OSR2
340        SFXN5
341       CCHCR1
342      ZSCAN26
343        APOL6
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400      GPRASP2
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470        SIPA1
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473        FOXN3
474         BDH1
475          CFD
476          GRN
477      ZFYVE26
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499   FAM111A-DT
500         CHD6
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555        SPDEF
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570      CABLES2
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575       ANKMY2
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577    GABARAPL1
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648        ZMYM3
649       PRSS23
650       MB21D2
651       FN3KRP
652        UBXN6
653       PNPLA2
654        AKIP1
655      SLC12A7
656        FOXJ1
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658       CYB5R3
659         PNKD
660          RFK
661        MEGF8
662          MDK
663         PJA2
664        NCOA2
665        PHF12
666       CCDC34
667       ENTPD2
668         GAB1
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670        CDK19
671     ARHGEF19
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673       CLSTN3
674        PGAP3
675        FNIP1
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677        HOXB9
678        PARP9
679      EPS15L1
680        THAP3
681     SELENBP1
682         IDH1
683         ACP2
684        ACER2
685        MAGI3
686         GGT1
687        MED16
688        MPPE1
689         COMT
690        CENPC
691        TUFT1
692      PLEKHF2
693     RABGAP1L
694       FAM13A
695       PNPLA6
696         PTK6
697        MZT2A
698        TTYH3
699        SIRT3
700         GPX1
701       TCIRG1
702          GAA
703         ECI1
704      SLC24A1
705     TRAPPC11
706       PHLDB1
707      IRF2BP2
708        NR1I2
709         GBF1
710      NFKBIL1
711        LRIG3
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713     TRAPPC6A
714        PTPRF
715        PRRG2
716       CAPN15
717      TBC1D2B
718       AMBRA1
719        STK38
720       CREBZF
721        SUSD6
722        OVOL1
723         FBRS
724       ACAD10
725          CIT
726         ZER1
727        PTPRU
728        ATG4C
729       RAVER2
730       RABEP2
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732         MAOA
733         SDF4
734        DAAM1
735         H2AJ
736        PITX1
737         MGMT
738     ALDH16A1
739         SPG7
740         ARSD
741       SAMTOR
742       KCTD18
743        STUB1
744        RPRD2
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746        SGSM2
747       RHBDD2
748      TP53I13
749         ESAM
750       SH3GL1
751        INTS1
752       GRIN2B
753      PPP2R5D
754        RRAGC
755         COPE
756        SIMC1
757       CLSTN1
758       ACTMAP
759      TBC1D13
760      CRACR2B
761        CDAN1
762         TSKU
763         PLD3
764         COQ5
765        LTBP3
766         TAB1
767    TNFRSF11A
768        NAPRT
769         MUC1
770         ELOB
771        KIF1B
772          CIC
773       ZNF687
774        NR1D2
775       PEX11B
776      CCDC124
777         ALPP
778       SEMA4G
779         SDC1
780       PI4K2B
781         AKNA
782       AKR7A2
783         ALS2
784      SLC25A1
785         LRP6
786       IFT140
787        FOSL2
788       CELSR1
789          OAF
790         VRK3
791        KDM4B
792        FBXL6
793        DNPH1
794        BAMBI
795        LMAN2
796         GPX3
797       VSTM2L
798        NCOA3
799        MRTFB
800       SCARB2
801       LRPAP1
802        USH1C
803        TAOK2
804         SCAP
805         PTEN
806        MARK4
807        RCAN1
808        USP18
809         ETV6
810      FAM220A
811       ATP2A3
812         FZR1
813        MKRN1
814        DDAH2
815      FAM193A
816     TMEM161A
817       HEXIM1
818     C6orf136
819         TFF2
820         POLL
821        NSUN7
822        EPHB4
823     TNFRSF14
824        RGS12
825      METTL26
826         NBDY
827         TOX3
828        CASP9
829         CBX8
830        ANO10
831         FZD5
832       CDC25C
833      GRAMD1A
834       SORBS1
835       PDXDC1
836          CAT
837        DAPK3
838    RAB11FIP1
839         MPP7
840       SH3BP1
841       CEP295
842        NELFB
843         SLX4
844        IGSF3
845         TYK2
846       DLGAP5
847        FAM3A
848       CSTPP1
849       KLHL12
850     SLC25A11
851        FOXO3
852        CALM3
853          FRY
854          FTO
855         BBS2
856        ADCY6
857         CTSV
858        TDRD7
859     C19orf25
860      XPNPEP3
861         DPP7
862       AGPAT3
863         FBP1
864        RELCH
865       IQSEC2
866        RBM47
867      ALDH3A1
868      TMEM219
869       AKR7A3
870         QPRT
871        ATG2A
872        SPG11
873        BRPF3
874       ZNF627
875       FRMD4B
876        HOXA9
877        RAB20
878       MAD1L1
879        AP2A1
880      CARHSP1
881         SNX2
882     ATP6V0E2
883         EDC3
884        DNAL4
885      TBC1D31
886         TMC4
887        RAB5B
888     NUDT16L1
889       RPL18A
890        POLD3
891       PCMTD1
892        ACAP3
893         CD82
894       NUSAP1
895          BBX
896        ITM2C
897      TBC1D9B
898       TNRC6B
899         CUL7
900         PLD1
901    KIAA0319L
902      ARFGAP2
903         MUC4
904       ZNF652
905         MID1
906      TMEM263
907     TRAF3IP1
908        GNPTG
909          CPD
910        ACOX3
911         NCK2
912         SSH3
913      PIP5K1B
914        KLHL7
915        ACSF3
916        ELMO2
917      ZFYVE19
918        TARS2
919      ARL6IP5
920        USP19
921        HOOK3
922        IMPA2
923        TTC7A
924       ASPHD1
925        FYCO1
926       ZNF827
927        LAMB2
928        MTURN
929      ATP6V1A
930      GALNT12
931       CPPED1
932      MMP24OS
933        BCL9L
934        EEF2K
935        RNF20
936        MYO7B
937        DOP1B
938        TIGD2
939       GNPTAB
940        FBXW4
941         FCSK
942         FUOM
943       FBRSL1
944      MATCAP2
945        CPSF1
946     SLC38A10
947        MITD1
948        MAML3
949       CC2D1A
950        VPS51
951        SF3A2
952         LHPP
953        H2AC6
954        CASP3
955      RABGAP1
956         NEK2
957        PIAS3
958         ABL1
959       HECTD4
960      SLC44A4
961         TAF6
962         DNM2
963         H2AX
964        PACS1
965         NBR1
966        PLBD2
967         IDH2
968        NAGLU
969        COX5B
970       ABHD10
971      ARHGAP4
972        DAPK1
973      CREB3L1
974        RNF26
975       NHLRC3
976    LINC00511
977     ARHGAP35
978       MRPS34
979        TIMP2
980       MRPL43
981       LPCAT3
982          XPC
983     ALDH18A1
984        ZNF91
985         EVPL
986        CNNM3
987        CDHR2
988       DCAF15
989      PLEKHG1
990          ASL
991      RANBP10
992        NUCB2
993      TMEM259
994        UBAC1
995       TRIM14
996      DYNC2I2
997        LAMP2
998       CARD10
999      TSPAN15
1000        NARF
1001       RHOT2
1002        SUN2
1003       TRAF7
1004     ZFYVE21
1005      LRSAM1
1006      POLR2E
1007      COBLL1
1008       CRTC3
1009        PHYH
1010       CNNM2
1011        MIA3
1012      ATP8B1
1013         BSG
1014        SNX1
1015       PSKH1
1016         TST
1017      RNF141
1018       BLTP1
1019     CHCHD10
1020       PTPRA
1021        SYT7
1022       TTC9C
1023    C1orf210
1024       SNTB1
1025       CD151
1026      MGAT4B
1027      ZNF445
1028      STEAP2
1029       USP21
1030      RHBDL2
1031      SNHG32
1032    TBC1D22A
1033        LNX2
1034     SLC66A3
1035       GUCD1
1036     SPRING1
1037       HLA-E
1038       WBP1L
1039      MAPK14
1040       NRIP1
1041        CDT1
1042     ARHGEF9
1043       RPS15
1044        EDF1
1045      VPS13C
1046       C2CD3
1047        IRF2
1048       APPL2
1049     ARL6IP1
1050         DSP
1051      INPP5A
1052        CDS1
1053       TAOK3
1054        CTSH
1055       MTMR3
1056       PAQR8
1057       TCF19
1058     C2orf68
1059       KDM3B
1060       CRACD
1061       RPLP1
1062       SSNA1
1063       PEG10
1064     ATP6V1F
1065       CNOT1
1066       SNX30
1067        NFIX
1068        LIG1
1069     SHARPIN
1070       ACAD8
1071      PRSS12
1072        MTA3
1073     FAM168A
1074    ARHGEF11
1075      HECTD3
1076       BSDC1
1077      ACTR1B
1078    CDC42BPG
1079       PEX13
1080      ZNHIT1
1081      ABHD12
1082       TGIF1
1083      POLR2L
1084      ARID1B
1085       HERC2
1086       VPS28
1087      MAN1B1
1088      NDUFV1
1089       TCTN3
1090       ACAA1
1091     HTATSF1
1092      INPPL1
1093      BLTP3B
1094         JRK
1095     SPATA20
1096       AGBL5
1097      POLR2A
1098    RAPGEFL1
1099       ITM2B
1100       PGAP6
1101        CHDH
1102     TMEM141
1103       RPL36
1104        GCC1
1105      LANCL1
1106        ARF5
1107      LARGE1
1108      HSPA1B
1109      ADGRF4
1110        RFC1
1111       ATF6B
1112     SH3GLB2
1113       MLST8
1114    ANKRD13A
1115       USP25
1116       CERT1
1117        ISCU
1118      INCENP
1119       NHSL3
1120       ROMO1
1121     LRRFIP2
1122       FGFR4
1123       AZGP1
1124         NSF
1125        PKIB
1126       GNA11
1127      ZNF292
1128        PSAP
1129        RPS2
1130       DCAF7
1131       TOP2A
1132     TRAPPC9
1133       NISCH
1134        PIGS
1135       RSRC2
1136        BRD8
1137       MGRN1
1138         TK1
1139      POLR2J
1140        DVL2
1141       GSTP1
1142       NCSTN
1143       SERF2
1144       PLBD1
1145       PRDX5
1146       ERAP1
1147        TCN2
1148        CST3
1149       CCNG1
1150     ATP5IF1
1151      KIF20A
1152      TBC1D1
1153      MAGED2
1154      DAZAP2
1155     NADSYN1
1156        DOK4
1157        OAS3
1158     OSBPL1A
1159        NADK
1160        OCLN
1161        ACO2
1162      PARP14
1163       CD164
1164       OTUB1
1165      CABIN1
1166        SGK2
1167       TMED4
1168       ERMP1
1169        UPF1
1170      TXNRD2
1171        TTC3
1172        GUSB
1173         SP3
1174      SYNGR2
1175   TMPRSS11E
1176      LSM14B
1177       COPG1
1178        CBX6
1179        SCP2
1180       ARL4A
1181        CAPG
1182    APOBEC3C
1183        NET1
1184       ECHS1
1185         WLS
1186      NDUFB5
1187        CTSB
1188        MYH9
1189     SMARCC2
1190       SYNE2
1191        TPP1
1192        CHP1
1193        OSBP
1194      PRKCSH
1195        RTF1
1196        GID8
1197       RPL29
1198       USP9X
1199       COASY
1200      KDELR1
1201      UQCR10
1202        NUMB
1203       LMNB2
1204         FTL
1205       H3-3A
1206    RAB3GAP1
1207     RETREG2
1208     DNAJC13
1209       AP1B1
1210        CUX1
1211       ILRUN
1212         GNS
1213        ADD1

$Trametinib
          ID
1       CD37
2  LINC00543
3      EPHB3
4    SLC26A1
5     CHTF18
6     SAC3D1
7      CIRBP
8     RPUSD1
9       NOD1
10       MVK
11       MYB
12   PRKRIP1

$`Sorafenib-Trametinib`
           ID
1       BNIP5
2         BMF
3     RBBP8NL
4     MAB21L4
5     RASL11A
6         DBP
7       TMT1A
8       TCAF2
9       NUAK2
10     RASSF4
11    FILIP1L
12     CYP1A1
13    TNFSF10
14      ASCL2
15       CDX2
16      PALM3
17      HOXC6
18     ZNF775
19   PPARGC1A
20     SLC3A1
21       MYCL
22     INPP5J
23     PRR15L
24      ABHD8
25     ADRA2C
26      SESN1
27       PBX1
28     UNC93A
29     STEAP4
30     PIK3R3
31      AKAP5
32      MST1L
33    TNFAIP2
34     CDKN1B
35      PLCD1
36    GAL3ST1
37      SNX21
38     APOLD1
39    SLC2A12
40  ARHGEF10L
41     NOTCH1
42       LFNG
43    TMPRSS2
44    SLC40A1
45      NEDD9
46     RAB40C
47      HMOX1
48  LINC01224
49     GLYCTK
50      GCNT1
51      KCNK5
52    IRF2BPL
53       MXD3
54     PARP10
55  LIPT2-AS1
56       PRLR
57       MPP1
58      GPER1
59      MISP3
60      MSRB1
61     LRRC45
62      TRIM3
63       TNS3
64     ARID5B
65      PPM1H
66     CAB39L
67     MAP2K6
68       KLC4
69       TJP3
70      CXXC5
71        TEF
72      SPC24
73     AMDHD2
74     ZNF362
75      MYLIP
76     CDKN2C
77       TPRN
78    TSC22D3
79       CAPS
80       PDX1
81      RAB3D
82      MUC20
83       GALM
84       ALAD
85      KCNE3
86      DEGS2
87     FBXL15
88      GATA6
89      TSHZ1
90     B4GAT1
91     CITED2
92       TOM1
93       ELF3
94       SYBU
95      PKDCC
96     RAB40B
97     LPCAT1
98      HSPB1
99      FRMD1
100      EPN3
101   ZDHHC12
102    REPIN1
103    NDUFS7
104    MINDY1
105   PDE4DIP
106   KREMEN1
107    ACVR1B
108     IKZF2
109     NR2F1
110    RNF223
111   PPP1R3B
112     AGFG2
113     XYLT2
114     REEP6
115     PANK1
116     AJUBA
117    SPPL2B
118       HFE
119     ERBB2
120    PRUNE1
121      MXD4
122     KCTD7
123     BTBD2
124     ACADS
125     LZTS3
126      GAS6
127   TXNDC11
128     TONSL
129     TTC22
130      PKD1
131     CYTH3
132     MROH6
133    ATP10B
134  LBX2-AS1
135     SPSB2
136     NLRX1
137   NCKIPSD
138    NDUFB7
139     HNF1A
140     PLCH1
141      VWA1
142     FOXA1
143      RXRA
144     PDCD4
145     MFSD3
146    CAMK2G
147    NFKBIZ
148     PPDPF
149    IL17RE
150     ILVBL
151    LRRC66
152    GAS2L1
153    SH3BP4
154    CEP250
155    DGCR6L
156 HOXA11-AS
157    ZNF703
158      GYG2
159     ACBD5
160     LZTS2
161    ENGASE
162  SLC2A4RG
163    KLHL22
164    TENT5A
165     EHMT2
166     MLXIP
167   CAMSAP3
168   PPFIBP2
169    NUDT16
170     VMA22
171     CHLSN
172    SPMIP4
173   C2orf72
174     CLCN2
175 BAIAP2-DT
176     POLD1
177   TMEM129
178      WNK2
179      BRF1
180    TM7SF2
181   SLC17A4
182     NBPF1
183     RABL6
184   SIPA1L3
185      RGS2
186     FASTK
187    HDGFL2
188   FAM117A
189     WDR18
190   ABHD17A
191     FBXW5
192    HOXA13
193    RAVER1
194   MAP3K11
195      FUT2
196      CERK
197     DGCR2
198     PCNX3
199      TLE1
200    CELSR3
201     GSDMD
202  KIAA2013
203     KANK2
204     LIMK2
205      DTX4
206     SYTL1
207   UNC93B1
208    TRIM31
209    POFUT1
210    TMEM80
211   KAZALD1
212    RHBDD3
213    SREBF1
214   FAAP100
215   ZC3HAV1
216    RECQL4
217     ZBED1
218      MCM5
219     GATD1
Code
head(upSetSets(down_list))  # für runterregulierte Gene
$Sorafenib
               ID
1           FGF19
2         PPP2R2C
3           DUSP2
4          HK2-DT
5            ETV5
6          C2CD4A
7        HS3ST3B1
8           EPHA2
9          POLR1G
10         ZNF239
11          MARS2
12           EGR2
13           ETV1
14          DUSP7
15         ZNF485
16         ERRFI1
17       MAP7-AS1
18          IL17D
19           PLD6
20           RRS1
21          BEND3
22          TFAP4
23          UTP25
24           WNK4
25           FGF2
26            HK2
27         CDK5R1
28      LINC02418
29       C11orf86
30         KBTBD8
31           IL11
32          FFAR4
33       FLNB-AS1
34           FLT1
35           DKK1
36         UBIAD1
37           ECE2
38         GEMIN4
39          FOXL1
40          NABP1
41          NOP16
42          MON1A
43         FGFBP1
44        TRMT10C
45          DCAF4
46         LYSMD2
47         LRRC8A
48          TSEN2
49         ZNF860
50         CDC25A
51           COA7
52         ZNF121
53          KCNC4
54           GJC2
55          TFB2M
56         MAP6D1
57         HMGCS1
58           PLK3
59          LPIN1
60        SERTAD4
61          WNT7B
62         SLC7A2
63           BATF
64          FRMD3
65          FRMD6
66       SLC25A19
67         GPRC5A
68          DDX31
69         PMEPA1
70           SACS
71       C21orf91
72          NRARP
73         SLC9B2
74         SLC7A6
75         LONRF2
76        TMEM201
77         POLR3G
78         UTP14A
79           RCL1
80       C15orf62
81          SCML1
82          TXLNG
83         METTL1
84           NKRF
85        PAK1IP1
86         ZNF783
87          NOP56
88          PTPN7
89          AIRIM
90        KIRREL1
91         INAFM2
92         CCDC86
93           NOP2
94          RRP15
95       ZC3HAV1L
96          MANCR
97         EIF5A2
98           ROR1
99         POLR1F
100         DDIAS
101          MLKL
102       FDXACB1
103         CDIP1
104        KLHL21
105          UCK2
106         RIOX2
107        COL5A1
108         MILIP
109         ADAT2
110          UTP3
111       RHOBTB1
112         DUSP1
113          DPH2
114         PALS2
115         RAB36
116        POLR1C
117          NAGS
118          UTP4
119          AMD1
120        OTUD6B
121        FAM89A
122          ING5
123         KLF16
124         HDAC4
125     TNFRSF10D
126          STX2
127         KCNH8
128         PDE12
129         TEAD4
130          SAV1
131        SNHG15
132        CHAMP1
133          CGAS
134      C1orf216
135         CHAC2
136          PUS1
137        ZNF124
138          NCS1
139          NOL6
140         PCAT2
141         UTP23
142         P2RY2
143          GNL2
144     TNFRSF10B
145          RRP9
146           MNT
147        ZNF202
148          RRP1
149          YAE1
150         RGS17
151         CYTOR
152         FOXO1
153         NCOA5
154         FOXC1
155          TLE3
156          NLE1
157          EVX1
158         FKBP5
159        TP53RK
160         RBM28
161        IL1RL2
162       KRT8P12
163      TMEM185B
164        TLCD3A
165       CIMIP2C
166        INTS13
167          NOL8
168         HMGA2
169          DGKG
170       DCUN1D5
171         FSIP2
172       C3orf52
173        POLR3E
174         DUSP5
175        TRIM27
176        ALKBH2
177          URB1
178         CCNE2
179          CBX2
180       PLEKHM1
181       ZDHHC21
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184        DPYSL2
185        NT5DC3
186         RASA3
187         HMGCR
188       FAM210A
189        AMIGO1
190          PUS7
191          SQLE
192        NIPAL1
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194         RASA2
195         MSMO1
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198         WDR36
199          NAF1
200       TBC1D30
201        ZNF37A
202        GABPB1
203         FOXK1
204        SH2D3A
205        RNF138
206        POLR3A
207          CD55
208          LTV1
209        DNAJC2
210          USB1
211          SFPQ
212         XRCC2
213      ATP6V0A2
214        HOMER1
215          ESF1
216        PDCD11
217         EIF3J
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219          NXT1
220       DPY19L3
221       ISG20L2
222           ADO
223         RPP25
224        NFE2L3
225     MPHOSPH10
226        SMIM13
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228         SPRY1
229        RPL7L1
230         FAM3C
231         SH2D5
232        UBXN10
233          CDV3
234    RNASEH1-DT
235       PITPNC1
236          TLE4
237          ELK4
238         USP31
239         TIMM9
240         WDR12
241         UTP15
242        MIR621
243         CTPS1
244        IQANK1
245        ZNF696
246         MOSMO
247        HIVEP3
248        PDCD2L
249          IDI1
250        ZNF551
251      SLC25A33
252          LIG4
253       RPS6KA5
254        FBXO45
255         ABTB2
256         GRWD1
257       ALDH1B1
258         ABCE1
259          SOX9
260       TMEM87B
261         BMAL1
262       HSD17B2
263          NANP
264          UMPS
265         SYT12
266       SLC39A8
267          RIF1
268        GALNT4
269          ABL2
270         NOC3L
271          DDI2
272         ABCF2
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278        AGPAT5
279        TIMM8A
280      SLC25A15
281        SH3TC2
282          WDCP
283        ZNF699
284       SYNCRIP
285       PRPF38B
286          RELT
287        ZBTB24
288          KRI1
289         PPIL1
290          RNMT
291     EEF1AKMT1
292         ARMC6
293         RDH13
294         WDR75
295        LRRC58
296          PDP2
297          GNL3
298       TMEM192
299         ZNF35
300        TBXAS1
301        POLR2D
302          DKC1
303         MTPAP
304        IL20RA
305          NOL9
306        MAP7D3
307        ENTPD1
308        ADGRE2
309         NUP35
310       FAM117B
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313       FAM111B
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315        RHEBL1
316       MYBBP1A
317         PNPT1
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320          NPC1
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323         NOL11
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328         NAT10
329         ABHD6
330         CCRL2
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349       RAPGEF3
350          TMX4
351        ZNF641
352       DNTTIP2
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356       PCOLCE2
357         PRMT6
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359       SIPA1L2
360         MPRIP
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364         IL1R1
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367          MXD1
368        KLHL23
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370       METTL2B
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372          PWP1
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374         UTP18
375          PPIF
376        ZNF800
377         MCM10
378         SRSF2
379         CEBPZ
380        RABEPK
381         SDAD1
382       PLEKHO2
383          WDR4
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385           NLN
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389         POLE3
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392           NHS
393         PRDM1
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396        EEF1E1
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420          CLP1
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423        PHLDA2
424          ANKH
425        UBLCP1
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427          MAFK
428       SLC35C1
429         BICD1
430         UTP20
431         TRNT1
432         PLCB2
433         DMTF1
434        CHST11
435        POLR1A
436         P2RX5
437        SNHG16
438       FAM86B1
439         PANK3
440        FHIP1B
441         TIGAR
442        PTP4A1
443        ZNF883
444         RBM12
445          NOM1
446           NCL
447          TLN2
448      APOBEC3G
449      RASGEF1A
450        TMEM64
451         NOLC1
452         WDR35
453        POLR3D
454       C4orf46
455         DDX28
456        ZNF142
457          LMO7
458       HSD17B7
459          GRK2
460          UBA6
461          PIM1
462          PMS1
463          PMM2
464           MMD
465         UBXN8
466      MPHOSPH6
467         RIOK3
468          MRM2
469        P2RY11
470       KRT8P39
471      BNIP3P43
472        SLC5A6
473         PCF11
474         AP1S3
475         ISCA1
476        CAMKK1
477          AREG
478        DICER1
479         LCMT2
480         TRAM2
481         PRMT3
482          TFAM
483       SLC23A2
484          PWP2
485       FAM216A
486         SAMD5
487        MBLAC2
488         WDR77
489       DCUN1D3
490          ECT2
491  LOC105370792
492          BCAN
493         SHLD2
494         ZNF41
495       GNPNAT1
496         CEP41
497         CASP8
498        TRMT13
499       CEACAM1
500         CRLF3
501          JPH1
502          E2F6
503           RYK
504       SLC46A1
505        FAM83G
506         ATG9B
507         DDX18
508         AP1AR
509          RBM6
510         RUNX1
511         WSCD1
512         DIMT1
513         ZBTB2
514           MTR
515         YIPF4
516        KRT8P3
517          PDP1
518          ORC6
519        UBE2G2
520          PLAU
521       TRMT10A
522         DDX3X
523        ADGRA3
524        GOLT1B
525         SPAG1
526           MAX
527         IKZF5
528        ELOVL5
529        SPRYD7
530         NETO2
531         FARSB
532         UBL4A
533       CRACR2A
534        TXNDC9
535          HM13
536         DDX56
537         AP3M2
538       GTPBP10
539          MIOS
540         FBXO9
541       MIR22HG
542        LUC7L3
543        HIVEP1
544        ZNF544
545         JAGN1
546       CARNMT1
547         TIPIN
548        NUFIP1
549         MFAP3
550          GID4
551      ZMPSTE24
552         ARL5A
553         TRAF5
554         ZNF48
555        FAM81A
556        ZDHHC6
557          HPDL
558       DNAJB11
559          NOB1
560         DCAF1
561       POMGNT1
562         NAT8L
563          DGKH
564          BAG5
565          RPF1
566        SETMAR
567         GPR39
568        DNAJB6
569         EXTL2
570       C9orf40
571         MCTS2
572           SRM
573         ACER3
574          CHD1
575         NUP42
576         CHIC1
577          XPO5
578      SMARCAD1
579         KCNN4
580       RSL24D1
581         IL1R2
582        DCAF13
583       EEF2KMT
584          NAT9
585        ZNF367
586        PSMD12
587          GYG1
588       SUV39H2
589      DYNC1LI1
590      ANKRD13C
591        GRPEL2
592          ENC1
593          CD83
594         WDR89
595     C14orf119
596         REXO2
597          CCN1
598         MED17
599       AMMECR1
600          FEN1
601        MOSPD2
602         KLF10
603        STK17A
604         PA2G4
605         COPS3
606          SC5D
607          PKP2
608         TNPO2
609       SLC15A4
610       PCDHGC3
611          SKIL
612         PPM1F
613          LLPH
614        GXYLT1
615        DNAJA1
616        GEMIN6
617          YOD1
618         USP14
619          KRR1
620          DBF4
621         MIER2
622          ALG3
623        EXOSC4
624          EHD4
625          MCM8
626        RHBDF2
627        MRPL50
628       SLC12A8
629         KNOP1
630        METTL3
631          IMP4
632        YTHDF2
633         TAF1A
634          AAR2
635         PSME3
636         SRSF6
637          DENR
638          FAR1
639        SRFBP1
640         TRA2B
641       SLC17A9
642         LPAR2
643        POLR3K
644         FLAD1
645          KLF4
646          CHN2
647       ZNF587B
648          PIGM
649          KLF2
650       SLC12A4
651       TMEM267
652        KCTD15
653       ZKSCAN2
654         KIF1A
655        TMEM33
656        EXOSC2
657          MTF1
658          FLNC
659   FAM131B-AS2
660          HUS1
661           SF1
662         MAPK8
663         MSTO1
664         URGCP
665       IL22RA1
666   MIR4435-2HG
667         TTC17
668       FAM107B
669         EIF3B
670        RXYLT1
671        ACVR2B
672      C6orf141
673         RNF44
674        KCTD11
675         MORC2
676        ZC3H15
677          MCAT
678         PHTF2
679          TPK1
680         PDRG1
681        POLR3H
682         FRMD8
683         JMJD6
684         SRPK1
685       FASTKD2
686        ZBTB11
687       TMEM241
688         NTMT1
689        MAP2K4
690          FUT1
691        TCERG1
692          RRP8
693        PMAIP1
694         PRMT5
695          CDC6
696      SLC25A45
697     MAPK1IP1L
698         RFWD3
699         ETNK1
700        BTBD10
701          LTO1
702       FASTKD5
703         HEMK2
704         MOAP1
705        SEMA4B
706         RAI14
707         U2AF1
708        ZNF146
709          NOS3
710         DHODH
711       SLC27A4
712        ANKLE2
713          NMD3
714         MRPS2
715       SNRNP35
716         CDK17
717        ACTR3B
718          IRF3
719          RBMX
720       SLC37A3
721        SNRPD1
722         NSDHL
723       ATXN7L2
724        CSNK1E
725         MIEF1
726        ANGEL1
727         RAB35
728        ZNF639
729        OGFOD1
730          NUS1
731       SLC36A1
732         FUT11
733       FASTKD3
734       ZCCHC14
735     LINC01128
736          NFYA
737         EIF4E
738          XPOT
739        ZNF480
740         BICD2
741         SF3A3
742         RBM18
743         LETM1
744          BMP4
745       SLC41A2
746       TMEM209
747          E2F7
748         GNL3L
749     RAB11FIP2
750         RUBCN
751      SLC25A44
752         MPZL3
753        TENT4A
754          DPH1
755         MED10
756        ALKBH8
757        VANGL1
758        IQGAP3
759         USP42
760       SELENOS
761        ZSWIM6
762        MTERF3
763          MREG
764        EXOSC3
765          CD58
766       PIP5K1A
767       TBC1D15
768          REST
769         CHST3
770       EMILIN2
771        ZNF507
772         PUS7L
773        ATP11C
774           TES
775       ZDHHC14
776        ZNF473
777        VPS37B
778         TRIB3
779       DCUN1D4
780         RBM4B
781        CCDC50
782        ZNF589
783        ZNF649
784         TIAL1
785      EBNA1BP2
786        HNRNPF
787         DDX17
788         IFFO2
789       ARL14EP
790          WDR5
791          RRN3
792       B3GALT5
793        ZBTB47
794        RSL1D1
795       PLEKHA3
796        RNF149
797        SMCHD1
798        STXBP5
799      PPARGC1B
800        EXOSC6
801        GTF2H1
802          PREP
803          HLCS
804          MED6
805         RPP40
806         FTSJ3
807         POC1B
808        PM20D2
809          CLN8
810        CCNYL1
811          GLMN
812        EXOSC9
813        PKNOX1
814       C3orf33
815        ELOVL1
816          ODF2
817        RUVBL1
818        ZDHHC5
819         BCCIP
820         CCNT1
821         CEP85
822          ERI1
823         DDX55
824          ELK3
825        EIF2B3
826         NFXL1
827         IFRD2
828          SNRK
829         CWC22
830       SUPV3L1
831          RYBP
832         PTPRG
833        PRDM15
834           BIK
835         HAUS6
836         MCPH1
837         KPNA3
838        ZNF317
839         SRSF3
840         PRPS1
841       TIMM17A
842         TUBB6
843       C3orf70
844        LARP1B
845         INTS5
846        CEP135
847         PTAR1
848        EIF1AD
849         TCOF1
850         PGAM5
851        ZNF274
852         STON2
853         GINS3
854       SLC12A2
855        TUBAL3
856         KCTD1
857        CCDC59
858       TRMT61A
859          XRN2
860        FERRY3
861        TBCCD1
862       OSBPL10
863         DESI1
864         CBLL1
865         CUL4A
866          PUS3
867         BLZF1
868         NCBP2
869       SLC38A9
870         SMYD5
871        TBC1D4
872         CENPQ
873       SLC18B1
874         PSME4
875         JKAMP
876        ARPC5L
877        HSPA14
878        ABHD15
879        KLHL42
880        DNAJB9
881       HNRNPAB
882          KLC2
883          NEK7
884          WFS1
885        GPRIN1
886       PLEKHA2
887          SKA3
888        ASNSD1
889         GLRX3
890         MACIR
891          ICE1
892      SLC25A17
893          TMX3
894         SFXN4
895         TAF13
896        CYP1B1
897       ANAPC13
898          BAG2
899      TMEM120B
900          ETV3
901       NUP62CL
902         THAP1
903         ARIH2
904         PAQR4
905         USPL1
906         RBM19
907          RCC1
908      TGFBRAP1
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910        PAXBP1
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920         BCL7B
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1109     ARHGAP26
1110        CERS2
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1144          CAD
1145       FBXO30
1146        EIF1B
1147        PCDH1
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1151       ZNF561
1152         TUBB
1153         ELP1
1154     B3GALNT2
1155          SET
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1168          PTS
1169       CLASP1
1170       ATP11B
1171        SSBP1
1172       TOMM70
1173       HNRNPD
1174       TRIM25
1175        KCMF1
1176         GRK3
1177      FAM133B
1178      CSNK1G3
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1180        TMCC1
1181         TMX2
1182        RBM22
1183      MFSD14A
1184         BZW2
1185        MOCOS
1186         RAD1
1187       ZBTB7A
1188        RRP1B
1189         TNIK
1190        CAPN8
1191      MTHFD1L
1192        MCUR1
1193         MKKS
1194      DCLRE1C
1195        HDAC2
1196        NUP50
1197        KDM5B
1198         XPO4
1199        LEMD3
1200       CHRAC1
1201        NAA20
1202       METAP2
1203        SNU13
1204        MTMR6
1205       NUP160
1206       PPP4R2
1207        EARS2
1208          BLM
1209       PRKAG2
1210         CD46
1211         SVIL
1212        TMTC4
1213      ARHGDIA
1214         SS18
1215         BIN1
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1227         TTF2
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1230      FAM91A1
1231        PHF23
1232       RPH3AL
1233        STK35
1234       RIMOC1
1235        EXTL3
1236         IMP3
1237     ITGB1BP1
1238        GARS1
1239     CDKN2AIP
1240          GDA
1241       CDC123
1242      ZDHHC23
1243        ADPRS
1244        FKBP4
1245         EEA1
1246        MBNL1
1247       CTDSP1
1248       MRPS30
1249        CCNT2
1250      PPP1R10
1251        GNAI3
1252         BRD9
1253         YBX3
1254         MAP7
1255      CIAPIN1
1256         ELP2
1257         EIF6
1258     METTL21A
1259        MEPCE
1260       TMEM43
1261        CHEK1
1262        UBE2Z
1263        PCNX4
1264          LBR
1265        NSUN4
1266         FUT8
1267      MARCHF6
1268        MACC1
1269        DGCR8
1270         NPAT
1271        TMTC2
1272         CCNC
1273        PATZ1
1274       UBXN2A
1275        PSMC6
1276        SNX29
1277          RAN
1278         ATF4
1279        KRT20
1280        TRUB1
1281      TMEM248
1282        QSER1
1283     IVNS1ABP
1284        KDM1B
1285         RND3
1286         MFN1
1287        AIMP1
1288         DAP3
1289         EIF1
1290       POM121
1291       ENOPH1
1292        DYRK2
1293        TBRG1
1294        RRP7A
1295       ACTR1A
1296       EFTUD2
1297        CENPB
1298        PAICS
1299        CNOT7
1300        DARS1
1301        UCHL5
1302        IARS1
1303       STARD7
1304         ORC4
1305        TBL1X
1306      SERINC3
1307       RNF139
1308      CAPRIN1
1309        KMT5A
1310         RRM2
1311       EIF1AX
1312         ELK1
1313        PDCD2
1314       ZWILCH
1315        SSU72
1316        RNF13
1317        NCBP1
1318       GTF2A2
1319        WDR48
1320       FBXW11
1321        HSPA9
1322       MFHAS1
1323        MEF2A
1324      TMEM104
1325      ZDHHC18
1326         TBL2
1327       ZDHHC3
1328        C1QBP
1329        CPSF6
1330        MYO1E
1331        BRPF1
1332        HIPK3
1333        AAGAB
1334         NPM1
1335      METTL13
1336       ANXA10
1337        ROCK2
1338         TBK1
1339      ATP6V0B
1340        MCMBP
1341        YARS1
1342          WRN
1343        AXIN1
1344      ATXN7L3
1345         TUT7
1346        USP10
1347          MBP
1348       CHRNB1
1349        YWHAB
1350        PDE8A
1351        NAA50
1352       METTL5
1353         ZZZ3
1354       FBXO28
1355        SRP72
1356         ICA1
1357         PON2
1358        YLPM1
1359        EIF5A
1360        RC3H2
1361       CHMP2B
1362      SLC38A5
1363        RAB10
1364      SLC35B2
1365         GPD2
1366       KIF13B
1367         RCN1
1368        TRAF4
1369          HK1
1370         SRRT
1371         GUF1
1372      SLC35C2
1373        UBE3A
1374       OSBPL2
1375        CEBPG
1376       CEMIP2
1377       WRNIP1
1378        PFDN1
1379        DDX50
1380        TTLL4
1381         RNF6
1382       HNRNPK
1383        MRPL3
1384         HELZ
1385        SF3A1
1386      DENND6A
1387        UBFD1
1388       RAD23B
1389       HNRNPU
1390        FDFT1
1391        RARS1
1392        ACTR3
1393       MCM3AP
1394      RHOBTB3
1395        LARP1
1396       ABLIM1
1397       THAP12
1398       MRPL14
1399       VPS26C
1400        SATB1
1401        NOC2L
1402        CNOT9
1403         DHX9
1404       NUP205
1405         ATL2
1406          BCR
1407         CBX3
1408       KCTD10
1409       UBQLN1
1410       TMEM97
1411        CSE1L
1412       ZNF706
1413      SEC23IP
1414        SLMAP
1415        RNPS1
1416        KIF5B
1417       BCLAF1
1418        GNA12
1419     HSP90AB1
1420       ZDHHC9
1421        HSPA4
1422         ARF6
1423       ATP11A
1424         AVL9
1425         CCT4
1426      HNRNPH1
1427        RDH11
1428         IPO5
1429         ACLY
1430        SSRP1
1431        NOP10
1432     HSP90AA1
1433        SAR1A
1434     SEPTIN11
1435         ENO1
1436         DCTD
1437       PTGES3

$Trametinib
          ID
1       DSG3
2    SERTAD2
3  EEF1A1P16
4      PDE4D
5      FOXQ1
6     CDKN2B
7     TIPARP
8      IGF2R
9    TSC22D1
10   MT-ND4L
11     SPSB1
12     CFLAR
13  ARHGAP32
14   CEACAM6
15     KALRN
16      AFF4
17    MT-CO1
18   B4GALT5
19     SIDT1
20 CTTNBP2NL
21   ANKRD22
22     ATXN7
23       CA2
24  C1orf116
25    MIDEAS
26     HKDC1
27    MYL12A
28      UBR4
29      MTPN

$`Sorafenib-Trametinib`
              ID
1           TNS4
2          SPRY4
3          DUSP6
4          FOSL1
5       KIAA0040
6         SPRED1
7            MYC
8           HAS3
9           LDLR
10          IER3
11           AEN
12        MFSD2A
13         DUSP4
14          EGR1
15         HBEGF
16           LIF
17       NCR3LG1
18         CLDN2
19          ASB4
20         ARL4C
21         INPP1
22         TAF4B
23       UBASH3B
24         MEX3A
25          URB2
26          MAFF
27           FOS
28          LRP8
29        PHLDA1
30     LINC00973
31         CHSY1
32         OTUB2
33          TWNK
34         CMTM3
35           SHB
36         MYEOV
37          JAG1
38         ITGA2
39     TNFRSF10A
40      SERPINB8
41         DHRS9
42         NTSR1
43       SLC20A1
44         PPRC1
45          PHC2
46         ARL14
47          NRP2
48    ERVMER34-1
49         MAT2A
50          HAS2
51         SOCS3
52         CEMIP
53          GJB4
54          JCAD
55          TMC7
56   SLCO4A1-AS1
57      SERPINB5
58       SLC7A11
59         PALD1
60         WDR43
61       B4GALT6
62      CDC42EP2
63        ZNHIT6
64         CCND1
65           SHH
66          NIFK
67          POP1
68          E2F5
69         DDX21
70        ANTXR2
71      SLC25A32
72         GCNT3
73         CCNE1
74          EDAR
75          ETV4
76          YRDC
77         EPHA4
78       ONECUT3
79       NDUFAF4
80         EFNB2
81          PNO1
82        ZNF275
83        IL17RD
84       BNIP3P2
85         SMAD3
86         MAK16
87          TLR4
88          E2F3
89        DCBLD2
90         TGIF2
91          PLK2
92        POLR1B
93          EMP1
94      SERPIND1
95       SLCO4A1
96         PTRH2
97       TMEM154
98       ST3GAL1
99          EREG
100    TNFRSF12A
101       ELOVL6
102       GEMIN5
103        PRDM8
104        NR4A2
105        LRCH1
106          GLS
107         PPAT
108         NOCT
109          SFN
110         FHL3
111       ADGRF1
112       HS3ST1
113         IRS1
114         BYSL
115     STAMBPL1
116       TLNRD1
117       MAP2K3
118         NAB1
119     TNFRSF21
120      CAPRIN2
121         LYAR
122    LINC01819
123         GJB3
124         AGO2
125        GPAT3
126        KRT18
127        TRMT6
128         WDR3
129     SERPINE1
130      PHACTR3
131      ATG16L1
132       AMIGO2
133       LONRF3
134        RRP12
135         NIP7
136       SLC9A2
137        KLF13
138        STK10
139        STK40
140         HRH1
141        ITGA6
142         SFR1
143         SMOX
144         KDSR
145        RIOK1
146         ETS1
147      TRABD2A
148          F2R
149       SLC4A7
150       LRRC8B
151      SLC45A3
152       ZNF697
153        RDH10
154      CHORDC1
155      SLC38A2
156      PPP1R18
157         ASB1
158        BRIX1
159         TOP1
160         SGK1
161       FERMT1
162        MYADM
163     ITPRIPL2
164         MAFG
165    TNFRSF11B
166       SOWAHC
167         GJB2
168      SLC35F2
169        PANX1
170      ADORA2B
171        THSD4
172         NRP1
173          PNP
174          AHR
175        MRGBP
176        PLEK2
177         POGK
178        LAMA3
179      SLC35B4
180       TRIM15
181     TNFRSF1B
182      ARHGEF2
183        FOXN2
184        SEH1L
185      GPR137B
186       BCL2L1
187       GRPEL1
188       PTPN12
189       ADGRG6
190         RPF2
191         DDX5
192         CDK6
193       CSRNP1
194          LCK
195       GTPBP4
196        HSPA8
197     SLC39A10
198       ZNF562
199       ADGRE5
200         EGFR
201          PVR
202     ARHGAP29
203        MACO1
204       INO80C
205      FAM135A
206      RASGRF2
207        TRIB1
208         MTAP
209        F2RL1
210        CDCP1
211       LRATD2
212       SPRED2
213         DGKE
214      SINHCAF
215        SATB2
216         NAB2
217      SLC38A1
218         MDN1
219         CCNJ
220        SETD7
221         AQP3
222         ELOA
223       CHCHD4
224        NSUN2
225       B3GNT3
226        SRSF7
227          TDG
228        SOCS4
229         IER2
230        CMTR2
231       TASOR2
232        EHBP1
233       KLHL18
234      DPY19L1
235       SLC7A1
236       SH3RF1
237        BCL10
238       TGFBR2
239     CDC42EP3
240         IRS2
241       PITPNB
242      SDR16C5
243        BACH1
244        CANT1
245       ARID3B
246       CFAP97
247       TCF7L2
248       MICAL2
249        ATOSB
250        DHX15
251     VKORC1L1
252        NAA25
253      SERTAD1
254          MET
255       EIF2S1
256         MCL1
257        PTPRE
258         GART
259         SBDS
260       HEATR1
261        TRNP1
262        HSPH1
263       NUDCD1
264         CCT2
265       ZNF770
266        UTP11
267       GAREM1
268     CDC42SE1
269         CHD7
270      CAMSAP2
271        MST1R
272        CLCF1
273         ETF1
274      SLC16A1
275        MORC4
276        DDX10
277        PRRG1
278       AHCTF1
279        OTUD4
280        SOX13
281        NAA15
282        NUP58
283      ABHD17C
284         KLF6
285    LINC00460
286       KIFAP3
287        SGMS2
288      LRRFIP1
289       PHETA1
290          GNE
291 LOC105378305
292         LCOR
293        CLOCK
294       TM4SF1
295        QSOX2
296      PIK3AP1
297        IRAK2
298      BNIP3P4
299         TANK
300        TACC1
301       MTHFD2
302        DIP2B
303        LARP4
304        KDM7A
305      SLC30A7
306          SLK
307       NFE2L2
308        KPNA4
309        MFSD6
310         CBFB
311       CEP170
312       SMURF2
313         MIDN
314          VDR
315         BZW1
316       RABEP1
317        TRIM8
318        NEMP2
319        HMOX2
320         TGFA
321   CSGALNACT2
322       IFNGR2
323        CYTH2
324      RAP1GAP
325        MAPK6
326     AMMECR1L
327          GEM
328        BAZ1A
329         SETX
330        ARL5B
331        SPRY2
332        EEPD1
333         MALL
334        ASAP1
335        RAD18
336         PUM3
337        PPARG
338        ABCC1
339        SH2B3
340        ASAP2
341     SLC25A24
342        PEA15
343       KBTBD2
344       NUP153
345       HMGXB3
346      CCDC88A
347         TFRC
348         LTBR
349        GSPT1
350     C6orf132
351       B3GNT2
352        RASEF
353         ZPR1
354          MGA
355       PPP3CA
356       LPGAT1
357        RASA1
358        NR1D1
359       TUBA1C
360        RCOR1
361         VEZT
362        LUZP1
363        GRB10
364         YAP1
365       MUC5AC
366        CELF1
367          MLX
368         FOSB
369        RAP1B
370      SELENOI
371       PPP3R1
372     BAIAP2L1
373        ITGA3
374        TNPO1
375        CYRIB
376        CTBP2
377     PRELID3B
378       LGALS8
379       TUBA4A
380         SNX9
381      AKIRIN1
382        TEAD1
383        NCEH1
384        PPTC7
385         PRNP
386        UBE3C
387     RAP1GAP2
388        ALAS1
389       TRIM16
390       STEAP1
391        PFDN2
392       PPP4R1
393         UBA2
394        MEAK7
395        CEP20
396         SOX4
397        PTPN3
398        ARAP2
399         PAK2
400        ACTG1
401         TJP2
402         TJP1
403     SERPINE2
404       RAB22A
405        IDH3A
406       RANBP9
407       NUFIP2
408      CAMSAP1
409         STAM
410        YWHAG
411         CHUK
412         FHL2
413     PAFAH1B2
414     KIAA1549
415       MAP4K4
416       TRERF1
417       CORO1C
418       FNDC3B
419     ARHGAP42
420      ITPRID2
421        MUC17
422      RPL6P27
423        MAML2
424        UBE2N
425        RESF1
426        MACF1
427      ST3GAL4
428        RHPN2
429       PTP4A2
430       ITPRIP
431       PLXNA2
432      CREB3L2
433         SUCO
434       RASSF3
435       PDLIM5
436          VCL
437     TNFRSF1A
438         TLR6
439        BPNT2
440       OSGIN2
441       PLSCR1
442      ZFP36L2
443       TXNRD1
444        USH2A
445       LRRC59
446         EAF1
447         TCP1
448        MED13
449        EPHB6
450         WWC2
451        MTMR2
452         STN1
453         STK4
454         IPO7
455      PHF20L1
456      PPP2R1B
457       MAPRE3
458        ACSL5
459         H1-0
460       B3GNT7
461          CBL
462         FGD6
463      B4GALT3
464       TOMM34
465       MRPS10
466        ZFP91
467       MAPRE1
468        PAQR5
469         CCT8
470         FEZ2
471         FAT1
472        MMGT1
473         MLPH
474       GTF2E2
475       PDCD10
476       PPP2CB
477     LEPROTL1
478         MANF
479      EPB41L1
480         VMP1
481        ANXA5
482       DIAPH1
483        DOCK7
484       ATP2A2
485     PPP1R15B
486        ARCN1

Jetzt kennen wir die Gene, die entweder durch beiden Medikamente oder auch nur in dem einen oder dem anderen verändert sind. Aber was machen wir jetzt damit? Wir können uns z.B. der Ressource “Molecular Signatures Database” (MSigDB) bedienen.

“MSigDB is a resource of tens of thousands of annotated gene sets for use with GSEA (gene-set enrichment analysis) software”.

Die “gene-set enrichment” Analyse ist eine Berechnungsmethode, mit der festgestellt wird, ob ein a priori definierter Satz von Genen statistisch signifikante, übereinstimmende Unterschiede zwischen zwei biologischen Zuständen (z.B. Phänotypen) zeigt. Anders ausgedrückt können wir damit bestimmen, ob die Gene innerhlab der oben bestimmten “Sets” einen signifikante “Funktion” haben und daraus schlußfolgern, dass diese “Funktion” in unserem Experiment verändert ist. Für die Analyse verwenden wir den Exakten Test nach Fisher oder auch hypergeometrischer Test. Die Funktion hyperG() für den Test stellen wir euch zur Verfügung.

Code
hyperG <- function(geneSets,DEgenes,universe, cutoff=0.1, mincount=2, parallel=T, adj.P.Val = F,
                   set.size = NULL){
  #' hyperG
  #' 
  #' @description Calculates Fisher's Exact test with the specified genes and the supplied gene-sets.
  #'
  #' @param geneSets list. Gene-Set the calculation is based on, e.g. go.bp
  #' @param DEgenes character vector. Gene IDs used for testing. Same identifiers as used for the gene-sets, e.g. ENTREZ IDs.
  #' @param universe character vector. Universe gene IDs.
  #' @param cutoff numeric. Cutoff used to identify sig. pathways. Default: 0.1.
  #' @param mincount numeric. Consider only pathways which contain at least mincount genes. Default: 2
  #' @param parallel boolean. Use parallel calculation. Default: TRUE
  #' @param adj.P.Val boolean. Use adjusted p-value for significance filtering. Is always calculated.
  #' @param set.size vector. Min and max size of allowed gene-sets. Default min:10 genes and max:500 genes.
  #'  
  #' @return the significant regualted pathways.
  #' @export
  #' @importFrom foreach, doMC
  
  require(foreach)
  require(doMC)
  if(parallel){
    registerDoMC(cores=detectCores())
    cores=detectCores()
  }else{
    cores=1
  }
  if(!is.null(set.size)){
    print('Set Size Limits')
    idx <- lapply(geneSets,function(x){length(x) <= set.size[2] & length(x) >= set.size[1]})
    geneSets <- geneSets[unlist(idx)]
  }
  l <- length(setdiff(universe,DEgenes))
  DElen <- length(DEgenes)
  results <- mclapply(1:length(geneSets), function(i){
    results <- matrix(data=NA,ncol=7,nrow = 1)
    colnames(results) <- c('Term','Count','Size','p-value','adj.P.Val','odds ratio','GeneIDs')
    geneSet <- intersect(universe, geneSets[[i]])
  e <- intersect(DEgenes,geneSet)
    a <- length(e)
    b <- DElen - a
    c <- length(geneSet) - a
    d <- l - c
    contigency.matrix <- cbind(c(a,b),c(c,d))
    res <- fisher.test(contigency.matrix,alternative = 'greater')
    results[1,'Term'] <- names(geneSets)[i]
    results[1,'Count'] <- a
    results[1,'Size'] <- length(geneSets[[i]])
    results[1,'p-value'] <- res$p.value
    results[1,'odds ratio'] <- res$estimate[[1]]
    # find genes annotated in the consensus term
    if(a > 0){
      genes <- intersect(DEgenes,geneSet)
      eid <- genes
      eid <- eid[order(eid)]
      results[1,'GeneIDs'] <- paste(eid,collapse="|")
    }
    return(results)
  }, mc.cores=cores)
    
  results <- as.data.frame(do.call(rbind, results))
  for(i in c(2, 3, 4, 5)){
    results[, i] <- as.numeric(as.character(results[, i]))
  }
  
  if(nrow(results) != 1){
    results <- results[order(results[,'p-value'],decreasing = FALSE),]
  results[,'adj.P.Val'] <- p.adjust(results[,'p-value'], 'BH')
  if(adj.P.Val){
    results <- as.data.frame(subset(results,results[,'adj.P.Val']<=cutoff))
  }else{
    results <- as.data.frame(subset(results,results[,'p-value']<=cutoff))
  }
    results <- as.data.frame(subset(results,results[,'Count']>=mincount))
  }else results <- as.data.frame(results)
  
  return(results)
}

Außer der Funktion benötigen wir noch die entsprechenden Gensets/ Signalwegen, die uns interessieren. Diese können wir direkt über ein R Paket von MSigDB (msigdbr) beziehen. Auch hierzu stellen wir euch eine Funktion zur Verfügung, die das abrufen und erstellen der passenden Gensets vereinfacht. Wir laden uns damit die “Hallmark Gene Sets” direkt mit den Gen-Symbolen der Gene als IDs. Das geladene Genset ist eine Liste, die direkt als Input für die Funktion hyperG() verwendet werden können.

Code
get_geneset_ag <- function(
  species = "Homo sapiens",
  category = NULL,
  subcollection = NULL,
  format = "entrez"
) {
  require(msigdbr)
  db_df <- msigdbr(species = species ,category = category, subcollection = subcollection)
  if(format == "entrez"){
    m_list = db_df %>% split(x = as.character(.$entrez_gene), f = .$gs_name)
    for(idx in 1:length(m_list)){
      m_list[[idx]] <- unique(m_list[[idx]] )
    }
    return(m_list)
  }
  if(format == "symbol"){
    m_list = db_df %>% split(x = .$gene_symbol, f = .$gs_name)
    for(idx in 1:length(m_list)){
      m_list[[idx]] <- unique(m_list[[idx]])
    }
    return(m_list)
  }
  if(format == "df"){
    return(db_df)
  }
}
Code
# load Hallmark gene set
hallmark <- get_geneset_ag(species = "Homo sapiens", category = "H", format = "symbol")

Um die Funktion hyperG() ausführen zu können brauchen wir jetzt noch ein sog. “universe”. Dieses beinhaltet alle Gene, die in unserem Experiment enthalten sind. Das “universe” ist ein Vektor, der alle Gene als Symbole beinhaltet. Es sollten keine NAs und/ oder Duplikate enthalten sein.

Erstellt das “universe” und führt die funktionelle Analye/ Gene-set Enrichment Analyse mit der hyperG Funktion und den Hallmark Signalwegen durch

Code
# Extrahiere die ENSEMBL-IDs aus dem dds-Objekt
ensembl_ids <- rownames(dds)

# Verknüpfe mit gene_reference, um die Symbolnamen zu erhalten
universe_df <- tibble(ENSEMBL = ensembl_ids) |>
  left_join(gene_reference[, c("ENSEMBL", "Symbol")], by = "ENSEMBL")

#  Erstelle das Universe
universe <- universe_df$Symbol |> unique() |> na.omit()

2.4.1.3 Gemeinsamkeiten: Durch beide Medikamente hoch-regulierte Hallmark Gensets

Code
top_enrichment_plot <- function(ds, title) {
  top_enrichment <- ds |> 
    slice_min(order_by = `adj.P.Val`, n = 10)

  ggplot(top_enrichment, aes(x = reorder(Term, -`adj.P.Val`), y = -log10(`adj.P.Val`))) +
    geom_col(fill = "steelblue") +
    coord_flip() +
    labs(
      title = title,
      x = "Pathway",
      y = "-log10(adj. p-value)"
    ) +
    theme_minimal()
}

enrichment_up_sora <- hyperG(hallmark, up_sora, universe, cutoff = 0.05, adj.P.Val = TRUE)
top_enrichment_plot(enrichment_up_sora, "Top Enriched Hallmark Pathways (Sorafenib UP)")

Code
## Interpretation (KI-unterstützt)
## ==============
## Die Behandlung mit Sorafenib führt zu einer signifikanten Hochregulation von Genen, die mit dem Zelltod (Apoptosis, p53), zellulärem Stress (zB Uv-Antwort), Immunantwort (Interferon Gamma) und Stoffwechselprozessen (Adipogenese, Häm- und Peroxisomenstoffwechsel) assoziiert sind. Dies unterstützt die bekannte cytotoxische und wachstumshemmende Wirkung von Sorafenib auf zellulärer Ebene.

enrichment_up_tram <- hyperG(hallmark, up_tram, universe, cutoff = 0.05, adj.P.Val = TRUE) # empty???
top_enrichment_plot(enrichment_up_tram, "Top Enriched Hallmark Pathways (Trametinib UP)")

Code
## Interpretation
## ==============
## ?

2.4.1.4 Gemeinsamkeiten: Durch beide Medikamente runter-regulierte Hallmark Gensets

Code
enrichment_down_sora <- hyperG(hallmark, down_sora, universe, cutoff = 0.05, adj.P.Val = TRUE)
top_enrichment_plot(enrichment_down_sora, "Top Enriched Hallmark Pathways (Sorafenib DOWN)")

Code
## Interpretation (KI-unterstützt)
## ==============
## Sorafenib führt zur signifikanten Herunterregulierung von Genen, die an Zellwachstum (MYC, mTORC1, G2M), Zellzyklusprogression, Entzündungsreaktionen (TNFα/NFκB) und Stressantworten beteiligt sind. Diese Ergebnisse sprechen für eine starke antiproliferative und antiinflammatorische Wirkung des Medikaments, ergänzt durch eine Hemmung zellulärer Überlebenssignale.

enrichment_down_tram <- hyperG(hallmark, down_tram, universe, cutoff = 0.05, adj.P.Val = TRUE)
top_enrichment_plot(enrichment_down_tram, "Top Enriched Hallmark Pathways (Trametinib DOWN)")

Code
## Interpretation (KI-unterstützt)
## ==============
## Trametinib führt zu einer ausgeprägten Unterdrückung entzündungsbezogener Signalwege (TNFα/NFκB, IL-2, IL-6, STAT3), Zellüberlebenssignale sowie Komponenten der MAPK-Kaskade (KRAS). Diese Ergebnisse sind kompatibel mit dem Wirkmechanismus von Trametinib als MEK-Inhibitor und deuten auf eine kombinierte hemmende Wirkung auf Proliferation, Entzündung und Stressantwort hin.

3 Anhang

Code
sessionInfo()
R version 4.5.0 (2025-04-11)
Platform: aarch64-apple-darwin20
Running under: macOS Sequoia 15.5

Matrix products: default
BLAS:   /Library/Frameworks/R.framework/Versions/4.5-arm64/Resources/lib/libRblas.0.dylib 
LAPACK: /Library/Frameworks/R.framework/Versions/4.5-arm64/Resources/lib/libRlapack.dylib;  LAPACK version 3.12.1

locale:
[1] en_US.UTF-8/en_US.UTF-8/en_US.UTF-8/C/en_US.UTF-8/en_US.UTF-8

time zone: Europe/Vienna
tzcode source: internal

attached base packages:
[1] parallel  stats4    stats     graphics  grDevices utils     datasets 
[8] methods   base     

other attached packages:
 [1] ashr_2.2-63                 Rtsne_0.17                 
 [3] readxl_1.4.5                BiocParallel_1.42.1        
 [5] doMC_1.3.8                  iterators_1.0.14           
 [7] foreach_1.5.2               msigdbr_24.1.0             
 [9] UpSetR_1.4.0                EnhancedVolcano_1.26.0     
[11] genefilter_1.90.0           kableExtra_1.4.0           
[13] lubridate_1.9.4             forcats_1.0.0              
[15] stringr_1.5.1               dplyr_1.1.4                
[17] purrr_1.0.4                 readr_2.1.5                
[19] tidyr_1.3.1                 tibble_3.3.0               
[21] tidyverse_2.0.0             viridis_0.6.5              
[23] viridisLite_0.4.2           apeglm_1.30.0              
[25] ggrepel_0.9.6               FactoMineR_2.11            
[27] ggplot2_3.5.2               org.Hs.eg.db_3.21.0        
[29] AnnotationDbi_1.70.0        pheatmap_1.0.13            
[31] openxlsx_4.2.8              DESeq2_1.48.1              
[33] SummarizedExperiment_1.38.1 Biobase_2.68.0             
[35] MatrixGenerics_1.20.0       matrixStats_1.5.0          
[37] GenomicRanges_1.60.0        GenomeInfoDb_1.44.0        
[39] IRanges_2.42.0              S4Vectors_0.46.0           
[41] BiocGenerics_0.54.0         generics_0.1.4             

loaded via a namespace (and not attached):
 [1] RColorBrewer_1.1-3      rstudioapi_0.17.1       jsonlite_2.0.0         
 [4] magrittr_2.0.3          estimability_1.5.1      farver_2.1.2           
 [7] rmarkdown_2.29          vctrs_0.6.5             memoise_2.0.1          
[10] SQUAREM_2021.1          mixsqp_0.3-54           htmltools_0.5.8.1      
[13] S4Arrays_1.8.1          curl_6.3.0              truncnorm_1.0-9        
[16] cellranger_1.1.0        SparseArray_1.8.0       htmlwidgets_1.6.4      
[19] plyr_1.8.9              emmeans_1.11.1          cachem_1.1.0           
[22] lifecycle_1.0.4         pkgconfig_2.0.3         Matrix_1.7-3           
[25] R6_2.6.1                fastmap_1.2.0           GenomeInfoDbData_1.2.14
[28] digest_0.6.37           numDeriv_2016.8-1.1     irlba_2.3.5.1          
[31] textshaping_1.0.1       RSQLite_2.4.1           labeling_0.4.3         
[34] invgamma_1.1            timechange_0.3.0        httr_1.4.7             
[37] abind_1.4-8             compiler_4.5.0          bit64_4.6.0-1          
[40] withr_3.0.2             DBI_1.2.3               MASS_7.3-65            
[43] DelayedArray_0.34.1     scatterplot3d_0.3-44    flashClust_1.01-2      
[46] tools_4.5.0             zip_2.3.3               glue_1.8.0             
[49] grid_4.5.0              cluster_2.1.8.1         gtable_0.3.6           
[52] tzdb_0.5.0              hms_1.1.3               xml2_1.3.8             
[55] XVector_0.48.0          pillar_1.10.2           babelgene_22.9         
[58] emdbook_1.3.13          splines_4.5.0           lattice_0.22-7         
[61] survival_3.8-3          bit_4.6.0               annotate_1.86.0        
[64] tidyselect_1.2.1        locfit_1.5-9.12         Biostrings_2.76.0      
[67] knitr_1.50              gridExtra_2.3           svglite_2.2.1          
[70] xfun_0.52               DT_0.33                 stringi_1.8.7          
[73] UCSC.utils_1.4.0        yaml_2.3.10             evaluate_1.0.3         
[76] codetools_0.2-20        bbmle_1.0.25.1          multcompView_0.1-10    
[79] cli_3.6.5               xtable_1.8-4            systemfonts_1.2.3      
[82] dichromat_2.0-0.1       Rcpp_1.0.14             coda_0.19-4.1          
[85] png_0.1-8               bdsmatrix_1.3-7         XML_3.99-0.18          
[88] leaps_3.2               assertthat_0.2.1        blob_1.2.4             
[91] mvtnorm_1.3-3           scales_1.4.0            crayon_1.5.3           
[94] rlang_1.1.6             KEGGREST_1.48.0